临床检验中显微镜技术的正确应用

我们知道，尿液有形成分检查离不开应用显微镜。自从广泛使用显微镜技术检查尿液以来，对尿液的形态学研究已经有了明显的进展。现代显微镜检查技术已经不仅限于使用光学显微镜检查，显微镜检查技术可以使得进行肾脏疾病研究的肾脏病学家和检验专业人员，利用各种显微镜光学技术轻易识别尿沉渣中的各种成分。现代多功能显微镜均可选择多种视场照明模式，我们应该了解它们不同的特点，正确使用。

现代高端的多功能显微镜往往会配备不同的组件来处理我们所需要研究和鉴别的成分，这样我们可以在同一个视野下，通过切换不同的光源组件进行照明，来达到观察和鉴别的目的。可以使得研究肾脏病的专业人士能够使用各种照明技术轻易地识别尿沉渣的成分。而同时配合有显微镜数字相机时，更可以将所发现和观察到的形态学成分，在不同照明光源条件下拍摄和记录下来，方便进行对比研究与分析。本文对尿液有形成分检查常用的几种照明技术进行介绍，以便大家学习和了解，充分发挥显微镜的特殊功能。

1. 明视野：显微镜的成像原理：光线由光源处发出后，通过聚光镜形成配合接物镜的光锥，聚集的光线通过样本后，进入物镜。此时经过标本的光线会在接物镜与接目镜之间的镜筒中形成一个略有放大的倒立过渡实像。此过渡实像对于最终的成像品质具有决定性影响。镜筒上端是接目镜，接目镜通常具有一定的放大功能，在观看时应保持眼睛尽量接近目镜，才能看清完整的视野。因此所有视场光线改变的原理，都是在镜筒之下，聚光镜与物镜头之间形成的，凡标本细节未进入镜筒中形成过渡实像，后续的观察改变和放大都无法完成。

我们通常使用的显微镜照明技术就是明视野，但我们可能将其称为光学显微镜。光学显微镜采用明场照明（Bright-field）技术（图1），是最简单的技术方法，适用于所有显微镜，也就是我们最多使用的光学显微镜技术。该技术所有光源的光线是通过聚光镜，聚焦于标本上，在明亮的背景下形成深色的图像。使用这种方式，应将显微镜下面的聚光镜转台设置为“0”或“BF”模式（图1）。

2. 暗视野：检验专业领域所指的暗视野显微镜，是采用暗场（Dark-field）照明技术（图2），在大多数显微镜上也可用，在多功能显微镜下面的聚光镜中安装有一个不透明的暗视野盘片。在这种模式下，只有来自光源的周边的光聚焦在样本上，在黑暗背景下产生明亮的图像。高折射率沉淀物中的晶体和脂类等成分在暗场照明条件下显得格外“明亮”。使用暗视野功能应将聚光镜转盘设置为“DF”模式（图2）。

3.相位差：显微镜如果具有相位差（Phase contrast）功能，通过在聚光镜中使用“相位环（“phase annulus）”和物镜中使用反向“相位板（phase plate）”来改变光的路径（图3）。这种效果会增强物体边缘和低折射率元素的对比度（如管型中的透明蛋白基质）。这种成像方式需要一个装有特殊聚光镜和特殊相位对比物镜的显微镜。根据使用的物镜，将聚光镜上的转换盘设置为“Ph1、Ph2或Ph3”模式即可。

4. 偏振光：在使用偏振光显微镜中（图4），将一个偏光滤光片（偏光镜）放在聚光镜下面，另一个（偏光镜）放在样品上方的光路中（通常在物镜和观察镜之间的特定位置插入）。当将位于下面聚光镜上的偏振光镜片相对于插入到上面的偏光镜片进行旋转，当旋转90°时，所有偏振光被阻挡，图像背景看起来非常暗。光穿过载玻片上的各类具有屈光差的物体（如脂类、晶体和各种干扰成分）可呈现出双折射现象，这意味着光在两个方向上折射。额外的折射光能够通过显微镜的光学分析，从而在原本黑暗的背景下形成对比鲜明的物体。换句话说，图像对比度是由平面偏振光与双折射（或双重折射）样品相互作用产生的，产生两个单独的波分量，每个分量在相互垂直的平面上起偏振。

所有这些使用的方式通常是对观察有帮助的。例如（图5）在左上角的光镜视野图像中，我们看到的是圆形双凹面影像。在右上角图像的视野图像中，我们注意到这些物体具有高折射率，这意味着它们看起来相当明亮（典型的脂类或者结晶体）。在左下角的相位差图像中，我们注意到这些物质实际上在一个暗影包围中。在光镜下管型的蛋白质基质见不到，但在相位差视野下却很明显。现在我们看到的是管型内的椭圆形包含物，但还不能确定这些包含物是什么，可能为红细胞、脂滴、晶体等。但在右下角的偏振光视野下，我们看到这些包含体是双折射的，因此确定是结晶体。因此，我们知道最初的光学显微镜视野图像下可能不明显的是管型中的一水草酸钙结晶，而有了多功能的显微镜检查方法，对这种结晶管型的发现与鉴别就容易多了（图5）。

通过偏振光显微镜镜检技术很容易鉴别脂类、晶体和污染物，如淀粉和合成纤维。某些脂类显示出一种特征性的“马耳他十字（maltese cross）”现象，这种模式对于鉴别尿液中的脂质非常有用（图6）。

小结：经验告诉我们，相位差镜提供了对比度和分辨率的最佳平衡，而未染色沉淀物的薄片能获得最高分辨率的图像。对于染色标本或密度很高的沉淀物，相位差对比度结果则不是很好，这是由于沉淀物互相叠加导致对比度增强、光晕也相互重叠的结果。而染色也可导致反常的对比度降低。

暗视野对于低倍扫描玻片上的尿有形成分是非常有用的，可以很容易地识别管型、脂类和结晶体。当相位差镜的对比度不可用时，它也有助于识别在高倍镜下的棘红细胞。偏振光镜下可以让你验证脂质的存在，并帮助识别结晶体和外界混入物品。作为日常工作流程的一部分，请记住调整聚光镜焦距和视场光圈，将光源完全聚焦在正在观察的样本平面上，排除外来光干扰，并为所需的照明模式，选择使用正确的聚光镜转台设置。