超高效液相色谱-三重四级杆质谱联 用检测内源性皮质激素的方法建立
【摘要】针对肾上腺内分泌疾病的常见检测指标，以人血清中的醛固酮（Aldosterone，ALD）、皮质醇（Cortisol，F）、皮质酮（Corticosterone，CORT）作为研究对象，建立基于超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用（UPLC-MS/MS）的人血清皮质激素定量分析方法；建立了盐析沉淀-液液萃取血清样品前处理法，采用同位素稀释（Isotope Dilution，ID）法结合UPLC-MS/MS技术，对血清中的皮质激素进行定量分析，并进行方法学验证，包括仪器定量限和检出限、线性范围，方法的专属性、检出限、定量限、线性范围、回收率、精密度、基质效应和稳定性等。方法对于空白血清和人血清样本的检测都具有较高的特异性，目标峰附近无干扰峰检出。皮质醇、皮质酮线性范围在0.02-20ng/mL，醛固酮线性范围在0.05-20ng/mL，线性相关系数在0.995以上。皮质激素绝对提取回收率在60%-90%之间，方法回收率在90-101%，日内精密度小于13%，日间精密度小于18%。基质效应在85-108%，冻融稳定性在90-110之间，溶液稳定性在82-105%之间。
【关键词】皮质激素，超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用，同位素稀释，液液萃取皮质激素一种功能性类固醇，是生物体内重要的信号分子，它的生物合成由羟基类固醇脱氢酶和细胞色素P450酶调控，在体内各个皮质激素分子浓度水平的变化会相互影响，从而影响人的生理机能[1-3]。在人体组织中它们的含量极低，却在调节免疫系统、应激反应等生理活动中起着至关重要的作用[1, 2, 4]，因此人体皮质激素水平是内分泌、生理和病理学诊断的的重要参考依据[5]。目前，血清是临床检测中测量皮质激素的常见基质，血清中的激素浓度可以反映体内激素水平，通过测定游离皮质激素和总激素[6]，可即时确定体内皮质激素的变动。正常人体早上血清游离皮质醇水平在1.21-10.65ng/mL，总皮质醇含量为50-250ng/mL，下午为20-140ng/mL[7]，正
常成年人血清皮质酮为0.53-15.60ng/mL，未成年人在0.18-19.70ng/mL之间，正常人体血清中醛固酮10-210pg/mL[8, 9]。在CYP11B1缺乏症中，早晨检测血清皮质醇浓度通常低于70ng/mL，皮质酮和醛固酮的浓度则在正常参考范围以上[10]，在CYP11B2缺乏症中则相反，皮质醇浓度正常，而皮质酮和醛固酮浓度很低[11]。原发性醛固酮增多症或者醛固酮分泌肾上腺肿瘤患者的血清醛固酮检测值通常处于高值区间内，肾上腺功能不全的患者血清醛固酮检测值小于低值。由于皮质激素的化学结构非常相似，且在人体内的浓度较低，如何建立特异性强、灵敏度高的人体皮质激素检测方法是目前临床生化分析检测面临的挑战[12-14]。目前迫切需要开发一种快速、灵敏的血清皮质激素定量分析方法。本文针对分析速度和样品高通量的需求，采用UPLC-MS/MS对皮质激素定量方法进行开发与优化，所开发的方法可进一步用于分析临床人类
血清样本，通过准确测定血清激素含量，可在临床上用于皮质激素监测、内分泌疾病诊断以及治疗与肾上腺有关的疾病，探索人类机体调控机能和疾病的发病机制，为血清皮质激素定量、药物代谢等研究提供参考。
一、材料和方法
1. 仪器与试剂：Waters Acquity超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQ-S三重四极杆串联质谱仪（美国Waters公司）；涡旋混合仪（MS 3 basic，德国IKA公司）；离心机（德国eppendorf公司）；氮吹仪（艾杰尔科技有限公司）；万分之一天平（德国赛多利斯仪器公司）。
甲醇（色谱纯，德国M e r c k 公司）；2 5 % 氨水（质谱纯，阿拉丁试剂有限公司）ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱（2.1×100mm，1.7μm）；实验用水为MilliQ超纯水。标准物质Aldosterone、Cortisol、Corticosterone购自上海源叶生物科技有限公司，内标物Aldosterone-D7、Cortisol-D4、Corticosterone-D4购自美国IsoSciences；叔丁基甲基醚（色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司）；乙酸乙酯、二氯甲烷（色谱纯，天津康科德科技有限公司）；硫酸锌（优级纯，天津元立化工有限公司）。
2．标准溶液配置：皮质激素标准储备液（1mg/mL）：准确称取皮质酮、可的松、醛固酮、皮质醇对照品10.0mg，分别置于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度线。置于-20℃保存，备用。皮质激素标准工作液（1ng/mL）：准确量取皮质激素标准储备液1mL，用空白血清稀释为1ng/mL血清皮质激素标准样本，置于-20℃保存，备用。同位素内标储备液（100ng/mL）：准确量取皮质醇-[D4]、醛固酮-[D7]、皮质酮-[D4] 母液（100μg/mL）10μL于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度线，置于-20℃保存，备用。
3. 样品制备：取1ng/mL血清样本100µL置于1.5mL离心管中，分别加入皮质激素同位素内标1 0µL 、0.3moL/L ZnSO4溶液5.0µL以及叔丁基甲基醚1000µL。涡旋混匀5min，在离心机上9rpm转速离心1min，完全沉淀蛋白质。取800µL上清液，氮吹仪吹干。加入100µL 50%甲醇水溶液置于涡旋仪中复溶，上机检测。
4 . UPLC-MS/MS测定条件：（1）质谱条件：离子源：电喷雾离子源，毛细管电压：3.0 kV
（ESI+）、1.0 kV（ESI-）；锥孔电压：35V（ESI+）、25V（ESI-），锥孔气流量：150L/Hr，离子源温度：1 5 0℃，脱溶剂气温度：60 0℃，脱溶剂气流量：1000L/Hr，碰撞气流速：0.18mL/min；雾化器压力：7.00bar。采用多离子反应监控（MRM）扫描方式，各
化合物离子对参数如表1。（2）色谱条件:色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100×1.7μm），柱温30℃，样品室温度4℃，流速0.3mL/min，进样量：2μL。流动相组成：A相：0.01 mM氨水，B相：乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5min，40%B，0.5～3.0min，40%～90%B，3.0～4.0min，90%B，4.0～4.1min，90%～40%B，4.1～5.0min，40%B。
三、结果
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UPLC-MS/MS方法开发结果：利用优化好的质谱条件和色谱条件，对1ng/mL皮质激素和同位素内标进样检测。各化合物的MRM色谱图见图1（色谱峰数值依次为保留时间、色谱峰面积）。
2. 血清样本前处理条件的优化和建立：基于UPLC-MS/MS进行分析检测，对血清中皮质激素的样品前处理方法进行研究，基于盐析蛋白沉淀研究最优的萃取条件，对液液萃取溶剂、沉淀剂体积以及萃取剂体积进行全面优化。主要从以下几方面展开：首先是对不同种类的提取溶剂进行选择，对比液液萃取和盐析蛋白沉淀结合液液萃取法，确定最优的提取方法和提取溶剂；然后以所选定的提取溶剂为前提，优化盐析蛋白沉淀剂的体积和萃取剂体积，最终建立图2所示前处理流程。
3. 皮质激素UPLC-MS/MS定量检测方法学验证：为了验证检测方法的适用性和可靠性，本章对血清皮质激素定量检测的方法学性能进行验证，内容包括专属性、线性关系（线性范围，线性方程，R2）、定量限、检出限、回收率、精密度等。
（1）专属性：将空白血清、1ng/mL皮质激素血清标准品和人血清样本按照前处理方法操作，上机检测，考察质谱方法的特异性。如图3，在空白血清样本检测中，皮质激素目标化合物色谱峰位置附近没有内源性物质或他外源性物质干扰，空白血清在皮质激素的保留时间附近处没有干扰物质的色谱峰，说明空白血清不干扰待测物的检出；1ng/mL皮质激素血清标准品色谱峰形尖锐，没有杂质的干扰；经实验分析，皮质激素在人血清样本的检测中，目标物色谱峰附近没有杂质峰被检出，表明前处理方法清除了大量的基质，方法具有良好的专属性。
（2）检出限和定量限：① 仪器检出限和定量限：仪器检出限是指能与仪器噪音相区别的，在一定的置信范围内最小检测信号对应被分析物的最低浓度，与仪器灵敏度有密切关系；定量限是指试样中被测物能被准确定量测定的最低浓度。通常一般以信噪比（S/N）大于且接近3确定检出限（LOD），S/N大于且接近10确定定量限（LOQ）。实验用50%甲醇水配制一系列皮质激素标准溶液（0.05、0.02、0.01、0.005、0.002ng/mL）上机检测，结果见表2。
② 方法检出限和定量限：方法的检出限是目标物在最低浓度下产生的检测信号，可以区别于空白样品信号值[15]。方法检出限是检测方法开发中很重要的一个参数，用于评估一个分析方法对于最低浓度的样品分析，具有重要意义[16]。
实验用空白血清配制含1ng/mL同位素内标的一系列血清皮质激素标准工作液（0.05、0.02、0.01、0.005ng/mL）。按照样品前处理方法操作，上机检测，结果显示：本方法对于皮质醇、皮质酮的质谱分析方法定量限在20pg/mL，检测限在10pg/mL，醛固酮的定量限在50pg/mL，检测限在20pg/mL，方法具有较高的灵敏度。
（3）线性范围：实验采用内标曲线法定量检测，以皮质激素色谱峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，对血清中待测化合物的浓度为横坐标，进行最小二乘法拟合，构建4种皮质激素的校正曲线。由图4可得醛固酮的线性范围在20-0.05ng/mL，皮质醇和皮质酮的线性范围均在20-0.02ng/mL，线性相关系数R2大于0.995，内标稳定性在15%以内。
（4）回收率和精密度：回收率包括提取回收率和方法回收率，表示分析方法从生物基质中提取分析物的效率，它用于评估样品制备方法从生物基质中提取分析物的能力。美国食品药品监督管理局（FDA）建议使用至少3个水平确定回收率[15]。①提取回收率和精密度：提取回收率也称绝对回收率，反映方法的萃取效率，与生物样品检测灵敏度有关，指从生物样本基质中回收得到分析物的响应值与标准品产生的响应值的百分比即为分析物的提取回收率[17]。主要用于考察在制备过程中造成的生物样品中待测分析物的损失，要求前处理方法的提取回收率稳定、精确、可重现，是前处理提取条件和提取溶剂选择的重要依据。
由表3得，皮质激素内标的回收率均在60%以上，对于皮质激素低、中、高浓度血清的绝对回收率在60-90%之间，目标物与内标的提取回收率相近，前处理方法具有良好的提取效果。提取回收率的日内精密度在15%以内，日间精密度在20%以内，说明方法具有良好的重复性。② 方法回收率和精密度：方法回收率（RR）也称相对回收率，方法回收率通过计算各浓度点的质量控制（QC）样品的平均实测浓度（ ）与标示浓度（S，即QC样品的理论浓度）的比值而获得式（2）。方法回收率主要用于考察准确度，两者的关系如式（3）所示。
由表4知，0.1ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL血清质控样本的方法回收率在90-105%之间。对于不同水平的血清质控样本检测值和标示浓度相对误差均在10%以内，具有良好的准确度。方法回收率的日内精密度在0.4-12.3%之间，日间精密度在3.2-12.6%之间。所开发的血清皮质激素定量检测方法具有良好的准确度和精密度。③ 基质效应：基质效应评价通过比较空白血清提取液加标后的响应值和纯标准品溶液的响应值来确定基质效应的强度，将基质效应量化[18]。按式（4）计算得到绝对基质效应。
实验取50%甲醇水配制的不同浓度水平皮质激素标准溶液（0.1、1.0、10.0ng/mL），上机检测，测得皮质激素色谱峰面积（A）。对空白血清按照“3.2.3”进行前处理操作，氮吹至干，加入0.1、1.0、10.0 ng/mL标准溶液，上机检测，测得皮质激素色谱峰面积（B），每个浓度3个平行。按照式（4）计算基质效应。
低、中、高的三个浓度的可接受无基质效应范围为85%-115%，若其值小于85%和大于115%时被认为存在离子抑制和离子增强作用[50]。根据表5，平行样本间的精密度小于10.8%，具有较高的重现性。不同浓度水平的血清皮质激素质控样本（0.1ng/mL、1.0ng/mL、10ng/mL）的基质效应在85.9%-108.5%之间，说明血清样本的前处理操作较大程度地减弱了基质效应，在可接受无基质效应范围内，本方法具有较高的基质清除作用，可满足检测要求。
4. 血清皮质激素检测方法的实际应用：本节取实际样本27例，为新鲜健康人血清，外观澄清，无溶血、黄疸及脂血，于-80℃冷冻保存。取100µL人血清，加入190µL空白血清进行涡旋混匀稀释，进行前处理操作，上机检测，对人血清中的皮质激素进行定量分析。
实验对27例人血清样本进行了UPLC-MS/MS定量分析，如图5所示，将UPLC-MS/MS检测的人血清皮质激素含量散点图与正常人体皮质激素参考范围值进行对比，可以观察到，仪器所检测到的皮质激素含量数值多数是在正常范围的区间内，可在临床上用于肾上腺皮质激素含量监测、内分泌疾病诊断以及治疗与肾上腺有关的疾病，可用于人体皮质激素含量监测，为内分泌疾病诊断提供诊断依据，为临床医学检验提供一定的参考价值。
四、讨论
人体内肾上腺皮质激素的含量与高血压、高血糖等疾病有关，是肾上腺增生、库欣综合症、醛固酮增多症等内分泌疾病的检测指标。近年来三重四级杆质谱技术在临床生化检测中的应用越来越广泛，具有灵敏度高、特异性好、分析速度快等特点，可很好地满足临床检测中对多种目标物同时进行高通量、高准确性定量的需求。文中对建立的UPLC-MS/MS定量血清皮质激素方法进行了一系列的方法学验证。根据FDA关于生物样品分析的相关要求，通过实验对所开发的方法进行方法学验证，对方法的适用性和可靠性进行评价。
文中还重点建立了液液萃取结合盐析蛋白沉淀的血清样本前处理方法。对比乙酸乙酯、二氯甲烷和叔丁基甲基醚对于血清皮质激素提取效率的影响，确定叔丁基甲基醚为第一萃取剂；以叔丁基甲基醚为第一萃取剂，对比乙酸乙酯、二氯甲烷和盐析沉淀剂硫酸锌对血清皮质激素提取效率的影响，确定盐析沉淀剂硫酸锌与叔丁基甲基醚萃取剂的组合对于血清皮质激素提取效果最好，3种皮质激素的最终提取效率在65-85%之间，开发出操作步骤简单，样品预处理时间短的前处理方法。
方法学验证中考察了质谱仪器的检测限、定量限、线性范围和精密度，检测方法的专属性、线性范围、定量限、回收率、稳定性、基质效应，其中皮质酮、皮质醇检测定量限20pg/mL，醛固酮检测定量限50pg/mL，线性相关系数在0.995以上，具有良好线性关系。在冻融循环和溶液稳定性验证中，检测浓度和质控样本平均浓度间的相对误差在20%以内，有较高的稳定性。将所开发的定量方法应用于人血清样本的检测，多数检测值在正常人体皮质激素参考范围值，可在临床上用于肾上腺皮质激素含量监测。
本研究探讨了基于UPLC-MS/MS的定量分析方法，根据现有的工作，有几点展望，为今后能够用于大样本量临床检测提供思路。首先是由于复杂生物基质中的特异性有限，在复杂基质激素质谱定量检测过程中，会发生质谱信号干扰，因此在不断提高血清激素定量分析的高通量的同时，应加强对色谱柱进行快速分离，降低基质效应；在复杂生物基质前处理过程中，应最大化降低人工操作的时间，加大推进全自动化技术，将自动化前处理技术与超高效液相色谱三重四级杆质谱技术在线结合，开发出操作更加简单快速定量检测方法；绿色化学一直是研究人员致力创新的领域，在复杂生物基质前处理操作中开，应使用环境更友好的处理方法，推进小型化处理技术的创新，使用更少的血清样本，减少前处理时间，提高提取效率。
