临床实验室核酸污染处理方法的研究

【摘要】本文以新型冠状病毒核酸检测实验室为例，探讨了75%酒精、新型核酸清洗液以及含氯溶液对实验室各种污染源、污染方式的清除效果。结果显示，酒精及含氯溶液对于污染的清除效果较弱，使用核酸清洗液可以有效的清除各类污染，且核酸清洗液没有含氯溶液腐蚀性的缺点，是分子生物学实验室较为理想的污染处理方法。

【关键词】分子生物学实验室；新型冠状病毒；污染；核酸清洗液

2019年末，新型冠状病毒2019-nCoV被首次发现感染人类，随后2020年新冠疫情在全球爆发。在疫情防控方面，新型冠状病毒核酸检测是发现、确诊感染病例的有效手段。近两年来，随着疫情防控不断升级，全国各地建立了一大批分子生物学检测实验室，这有效缓解了核酸检测压力。但是，由于检测实验室长时间运转、强阳性样本气溶胶污染、操作员操作不规范等各种原因，实验室污染的现象频频发生。实验室发生污染以后，轻则重新进行检测，重则实验室停止运转，必须等污染消除后才能继续使用。因此，亟需寻找一种有效的去除分子生物学实验室核酸污染方法。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种用于放大扩增特定的核酸片段的分子生物学技术，该技术于1985年被美国Kary Mullis等人发明[1]。PCR具有灵敏度高、简单快速、特异性好的优点，在新型冠状病毒检测方面，相较于抗原检测，PCR检测具有提前发现感染者、准确度高的巨大优势，因此，PCR检测是新型冠状病毒检测的金标准[2]。由于PCR技术的灵敏度极高[3]，如果发生实验室污染，就会导致假阳性的发生，这对于分子生物学检测实验室来说是极其致命的。一般分子生物学实验室的污染主要来源于以下几个方面：第一，强阳性样本气溶胶污染；第二，检测试剂盒内阳性质控品污染；第三，PCR产物气溶胶污染[4]。目前，处理实验室污染，一般采用含氯消毒剂喷洒、酒精擦拭和紫外灯照射处理的方法[5]，但是，含氯消毒剂具有较强的腐蚀性，不能处理仪器设备，酒精又有发生火灾的隐患，紫外照射只能将长片段核酸降解成短片段，不能完全降解核酸，对于长度为100~200bp的PCR产物污染，紫外照射的效果收效甚微。本实验通过对比75%酒精、新型核酸清洗液以及含氯溶液处理的方法，评估了各种处理方法对试剂盒阳性对照、PCR产物的清除效果，以期为分子生物学实验室的污染处理提供新的有效方法。

一、材料与方法

1. 试剂与仪器：主要试剂与仪器见表1。

表1. 主要试剂与仪器及厂家

2. 实验方法：（1）不同处理方法对核酸处理效果检测：使用核酸提取或纯化试剂提取核酸检测试剂盒中的阳性对照，并按照说明书要求将阳性对照进行扩增，获得PCR产物。将PCR产物于产物分析室稀释10000倍备用。

使用核酸提取或纯化试剂将核酸检测试剂盒阳性对照、稀释后的PCR产物纯化为核酸溶液，各取10μl于1.5ml离心管中，分别加入200μl TE Buffer（对照组）、浓度为2000mg/L的含氯溶液（实验组1）、75%酒精（实验组2）和核酸清洗液（实验组3），混匀后室温反应15min，随后使用核酸提取或纯化试剂纯化为待检样本，用于下一步PCR检测。

根据核酸检测试剂盒说明书，取待测样本20μl加入至20μl反应液中，体积共40μl，按照说明书反应条件进行检测，对比实验结果。

（2）核酸清洗液喷洒对核酸处理效果检测：使用核酸提取或纯化试剂提取核酸检测试剂盒中的阳性对照，并按照说明书要求将阳性对照进行扩增，获得PCR产物。将PCR产物于产物分析室稀释10000倍备用。

使用核酸提取或纯化试剂将核酸检测试剂盒阳性对照、稀释后的PCR产物纯化为核酸溶液，各取10μl滴于咽拭子上，将咽拭子固定并放置于实验室传递窗内，使用喷壶对准拭子喷洒TE Buffer（对照组）或核酸清洗液（实验组），15min后将拭子取出，置于TE Buffer内，剧烈震荡使拭子附着物溶于TE Buffer内，随后将TE Buffer添加至核酸提取或纯化试剂进行核酸提取纯化为待检样本，用于下一步PCR检测。

根据核酸检测试剂盒说明书，取待测样本20μl加入至20μl反应液中，体积共40μl，按照说明书反应条件进行检测，对比实验结果。

二、结果与分析

1. 不同处理方法对核酸处理效果检测：通过不同处理方法对阳性对照和PCR产物处理后，核酸纯化并进行检测。如图1（a）所示，阳性对照ORF1ab基因片段经处理后，对照组、实验组1、实验组2均出现了扩增，实验组3无扩增。同时，对照组、实验组1和实验组2的CT值相差不大；如图1（b）所示，阳性对照N基因片段被不同方式处理后，表现出与ORF1ab基因同样的效果。结果表明，含氯溶液和75%酒精在短时间内对于RNA的降解是有限的，而核酸清洗液可以有效地去除阳性对照中的RNA片段。

图1. 阳性对照不同方式处理后检测结果

如图2（a）所示，PCR产物中ORF1ab基因产物片段经处理后，对照组、实验组1、实验组2均出现了扩增，实验组3无扩增。同时，对照组、实验组1和实验组2的CT值相差不大；如图2（b）所示，PCR产物N基因产物片段被不同方式处理后，表现出与ORF1ab基因同样的效果。结果表明，含氯溶液和75%酒精在短时间内对于DNA的降解是有限的，而核酸清洗液可以有效地去除PCR产物中的DNA片段。

图2. PCR产物不同方式处理后检测结果

2. 核酸清洗液喷洒对核酸处理效果检测：通过喷洒不同液体对阳性对照和PCR产物进行处理，随后核酸纯化并进行检测。如图3（a）所示，阳性对照ORF1ab基因片段经处理后，对照组有明显扩增，而实验组无扩增曲线；同样的，如3（b）所示，N基因经处理后有同样的表现。这说明核酸清洗液通过喷洒的方式可以达到消除RNA污染的目的。

图3. 阳性对照经核酸清洗液喷洒后的检测结果

如图4（a）所示，PCR产物ORF1ab基因产物片段经处理后，对照组有明显扩增，而实验组无扩增曲线；同样的，如4（b）所示，N基因产物片段经处理后有同样的表现。这说明核酸清洗液通过喷洒的方式可以达到消除DNA污染的目的。

图4. PCR产物经核酸清洗液喷洒后的检测结果

三、研究结论

随着疫情防控的升级，各大医院、高校、检验所都开设了分子生物学实验室，在使用实验室的同时，实验室污染问题不容忽视。通过对比含氯溶液、75%酒精和新型核酸清洗液对核酸的清除效果，我们发现在短时间内核酸清洗液的效果最优；同时，我们模拟了核酸清洗液的使用工况，通过喷洒的方式就能够达到理想的核酸清除效果。核酸清洗液采用中性pH，反应条件温和、快速，是分子生物学实验室理想的核酸清除方法。

参考文献

Saiki RK., Scharf S., Faloona F., et al. Enzymatic ampkification of beta-flobin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia [J]. Science, 1985, 230(4732): 1350-1354.

董文学, 李靖, 张致英, 等. 新型冠状病毒 (SARS-CoV-2) 实验室检测策略[J]. 中国公共卫生, 2020, 36(12): 1838-1842.

年庆功, 段赶时, 史孟婧, 等. 荧光定量RT-PCR试剂和反应条件对检测灵敏度的影响[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2018, 41(01): 1-4.

李云龙, 张健, 魏艳秋, 等.分子诊断实验室去除核酸污染的方法学研究[J]. 生物工程学报, 2021, 37(02): 673-679.

王哲, 秦怡璠, 王一萍, 等. 分子诊断实验室核酸污染清除方法研究[J]. 顺德职业技术学院学报, 2022, 20(02): 5-9.