免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117
【摘要】 目的： 探讨用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting,MACS）从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法： 收集小鼠骨髓细胞, 台盼蓝染色观察其活力，用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果； 未分选前CD117细胞纯度为(41.56±18.77)%，MACS分选CD117细胞纯度(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P<0.05）。结论： MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。
【关键词】 造血干细胞 CD117+细胞 免疫磁珠分离法 小鼠 近交BALBC
造血干细胞（HSCs）研究面临的首要问题是获得大量纯化的造血干细胞,并去除杂质细胞对实验的干扰[1，2]，近年在纯化技术方面的研究不多，尤其是对小鼠的研究较少。CKit或干细胞因子受体SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要标志[3]，2006年采用免疫磁珠分离法(MACS)分选骨髓造血干细胞亚群CD117，并用流式细胞仪进行计数，希望为造血干细胞的纯化和大量制备提供实验方法和理论支持。
1 材料和方法
1.1 实验动物
BALB/C小鼠,(20±1)g,雌雄随机,10只/组，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。
1.2 试剂和仪器
BSA购自杭州四季青生物工程材料研究所,荧光标记小鼠抗体CD117PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自Miltenyi Biotec公司,流式细胞仪(FACS Calibur)购自BD公司。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠骨髓细胞收集
颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液（含2 mmol/L EDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，切除骨的两末端，用1 ml注射器（带4号针头）插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，直至骨发白，所得细胞过200目滤网，1 500 r/min离心10 min，小心去除上清液，加入5 ml缓冲液混匀，进行细胞计数。
1.3.2 MACs分离CD117细胞
1.3.2.1 小鼠系别细胞去除 用缓冲液按40 μl/107个细胞重悬小鼠骨髓细胞。加入生物素化抗体混合物10 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育10 min。加入缓冲液30 μl/107个细胞，20 μl抗生物素微珠，混匀，4～8 ℃孵育15 min。加入5 ml缓冲液洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液。
1.3.2.2 磁性标记和分选CD117细胞 将分选后得到的细胞用缓冲液按80 μl/107个细胞重悬。加入CD117微珠20 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育15 min，缓冲液1 ml/107个细胞洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清，用500 μl缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1 500 μl缓冲液冲洗MS柱，此为CD117阴性细胞。将分选柱移出磁场，1 ml缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD117阳性细胞。
1.3.3 流式细胞仪分析
将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。在上述富集细胞管中加入100 μl缓冲液，10 μl CD117抗体混匀，4 ℃黑暗中孵育10 min，加入1 000 μl缓冲液1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液，加入500 μl缓冲液混匀，送流式细胞分析,设阴性对照和空白对照。
1.3.4 细胞染色计数
0.4% 台盼蓝按9∶1（V∶V，细胞悬液量：染色液量）对细胞进行染色。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。细胞活力的测定: 0.4% 台盼蓝染色1 min，计算活细胞率，活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。
1.4 统计学处理
用SPSS 11.1进行统计学数据分析，用配对样品t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓细胞的收集
从1只小鼠股骨、胫骨可收集5.25×107个骨髓细胞，细胞活力90%，2只小鼠股骨、胫骨可收集8.48×107个骨髓细胞，细胞活力92%。
2.2 MACS分选造血干细胞
1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个造血干细胞。
2.3 流式细胞仪分析结果
免疫磁珠纯化前CD117阳性细胞纯度为（41.56±18.77)% ，纯化后CD117阳性细胞纯度为(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P<0.05）。经免疫磁珠纯化后、未经免疫磁珠纯化小鼠骨髓干细胞收集物，流式细胞仪测定CD117+阳性细胞的纯度见图1。
3 讨论
骨髓内主要有两类干细胞群体,即造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)和间充质干细胞(MSCs)。HSCs是卵黄囊、胎肝和骨髓中比例极小的细胞群, 成
