尿液中8-oxoGsn生物标志物检测对社区老年人衰弱风险的评估价值

编译：姜珊   

校审：蔡剑平

（译自：Arch Gerontol Geriatr. May-Jun 2020; 88: 104038）

目前，人口老龄化已经成为我国一个极为严峻的社会问题，严重影响我国社会、经济等各方面的发展。我国65岁及以上人口占总人口比值已从2000年的7.0%上升到2019年的12.6%，这表明我国已进入老龄化社会。如何应对我国不断加速加深的人口老龄化？2015年世界卫生组织（WHO）提出“健康老龄化（Healthy Ageing）”概念，是发展和维护老年健康生活所需的功能发挥过程，其核心是提升个体内在能力和促进功能发挥，强调功能是衡量老人健康的标准，而非疾病。衰弱作为一种重要的老年综合征，是指随增龄出现的多个生理系统储备功能下降，机体的脆弱性增加，对抗应激源能力下降。衰弱是机体内在能力下降的重要阶段，是介于功能独立和功能丧失的中间状态，也被称为失能前期。研究显示，衰弱是多种不良结局如跌倒、失能、再住院、死亡的强有力预测指标。评估衰弱的生物标志物目前常用躯体功能指标如握力、步速，但人们一直在探索能从病理生理角度评估衰弱，更为准确及早期反映衰弱状态的生物标志物。

研究表明，炎症和氧化应激是导致衰弱的潜在病理生理机制。氧化应激被证实促进年龄相关性疾病发生发展，氧化应激对衰弱及功能的影响正逐渐受到重视。反映机体氧化应激水平的标志物多处于基础研究阶段。绝大部分炎症和氧化应激标志物检测均需留取血标本，对受试者是有创检查。如果能探索一个生物标志物与衰弱相关，且为无创检查，可在临床及社区广泛开展，有望成为衰弱早期筛查的工具之一。目前已知的氧化应激生物标志物中，8-脱氧鸟苷（8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine，8-oxo-dGsn）和8-氧化鸟苷（8-oxo-7,8-dihydroguanosine，8-oxo-Gsn）分别是DNA和RNA受氧化应激损伤后的重要代谢产物，并且主要从尿液排出，可通过尿液定量检测，反映机体氧化应激水平。前期的研究表明，8-oxo-Gsn对氧化损伤更敏感，更易在尿液中被检测发现，是极具应用潜力的RNA氧化损伤标志物。研究证明，尿8-oxo-Gsn与多种年龄相关性疾病有关。然而，关于这个标志物与衰弱的关系尚不清楚，国内外鲜有报道。本研究的目的是探索尿8-oxo-Gsn水平升高是否与社区老年人的衰弱风险增加相关，以及尿8-oxo-Gsn是否可成为一种评价衰弱的新方法。

一、对象和方法

1. 对象：连续入选2018年6月至2018年9月北京某老年社区居民230例为研究对象。纳入标准：（1）年龄≥75岁；（2）慢性病及功能状态稳定，无急性疾病情况；（3）自愿参加本研究并签署知情同意书。排除标准：（1）近2周有急性感染性疾病、非计划就诊或住院；（2）重度失能，日常生活能力（ADL）＜2分，不能行走；（3）重度痴呆患者，无法进行有效交流。

2. 临床基本资料收集：详细记录入选老年人的年龄、性别、身高、体重、并计算身体质量指数（BMI）；记录糖尿病、高血压、冠心病等基础疾病情况，并计算Charlson共病指数（Charlson comorbidity index），采用Charlson共病指数评估老人慢病分布情况。

3．衰弱评估：采用Fried衰弱表型诊断标准，包括5项内容：非自愿性体重下降、疲劳感、握力下降、步速减慢和低体能。每项内容为1分，评分范围为0～5分，0分为非衰弱，1～2分为衰弱前期，3分及以上为衰弱。

4. 功能评估：（1）生活能力评估：采用日常生活能力量表（ADL，Katz）包括如厕、进食、穿衣、洗澡、梳洗、行走6项内容；使用工具日常生活能力量表（IADL，Lawton）包括使用交通工具、做饭、服药、洗衣、打电话、理财、购物、做家务8项内容；（2）躯体功能评估：① 3米起立行走测试：从有扶手的椅子上站起来走3米，转身走回来坐下所需时间；② 简易躯体功能评估（SPPB）：包括5次起坐时间、平衡测试、4米步行时间，每项评分0～4分，以上3项评分的总和为SPPB评分, 评分范围为0～12分，躯体功能状态越差评分越低；

5. 炎症和氧化应激指标测定：炎症指标测定 血液样本的检测: 采集清晨空腹血清，hs-CRP应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测，最低检测值为0.08 ug/L，hs-CRP正常范围0～1mg/L；血白细胞(WBC)计数通过实验室常规检测方法获得。 

6. 尿液样本的检测：取所有入组老人清晨空腹中段尿装于15ml离心管中，即刻冻存于-80℃，将冻存的尿液解冻，37℃加热5min，4℃ 7500g离心5min（离心半径10cm），取200μl上清液于1.5ml离心管中，加入200μl工作液[70%甲醇、30%水、0.1%甲酸、30% 10mmol/L醋酸铵水溶液（pH=3.7）]，再分别加入浓度为480ug/L的同位素内标8-oxo-[15N213C1]Gsn和8-oxo-[15N5]dGsn，涡旋2min混匀，置于37℃生化培养箱中培养10min，然后4℃ 12000g低温离心15min（离心半径10cm）。最后取100μl上层清液，应用高效液相色谱串联质谱仪（modified ultraperformance liquid chromatography and mass spectrometry，UPLC-MS/MS）方法检测，并用尿肌酐含量进行校正，得出校正后的尿8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn含量，其单位为μmol/mol。

2. 统计学方法：应用SPSS21.0统计软件进行数据分析，对于正态分布计量资料采用x±s表示，3组间比较采用单因素方差分析组间的差异，组间两两比较采用LSD-t检验；非正态分布计量资料采用中位数（四分位数）[M（Q1～Q3）]表示，3组间比较采用秩和检验；计数资料采用例数或百分比描述，分类资料组间率的比较采用x2检验或Fisher精确概率法；（1）采用Pearson相关分析法分析氧化应激指标与躯体功能的相关性。（2）以衰弱为因变量，有序Logistic回归进行影响衰弱的多因素分析。（3）应用受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curves，ROC曲线）分析炎症和氧化应激指标对衰弱诊断价值，并推算最大约登指数确定最佳的衰弱界值。（4）采用有序Logistic回归，建立多种标志物联合的预测概率（Prediction probability）模型，再分析预测概率变量对衰弱诊断的预测能力。P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果  

（一）入组者一般情况及功能比较情况

1. 入组者一般情况：入组230例老人中，男性97例、女性133例，年龄范围75～94岁，平均年龄（83.9±4.4）岁（中位年龄84.0岁）。所有入组者，根据Fried衰弱表型诊断标准，分为衰弱组75名（33%）、衰弱前期组105名（45%）、非衰弱组50名（22%）。3组在年龄、BMI、Charlson共病指数方面比较差异有统计学意义（F/Z=21.358，5.466，27.137，均P＜0.05）。3组老人在性别方面比较差异无统计学意义（χ2 =1.107，P＞0.05）。（见表1）

2. 入组者功能情况：（1）生活能力评估:衰弱组、衰弱前期组、非衰弱组的ADL评分、IADL评分比较方面差异有统计学意义（Z=46.038，77.848，均P＜0.05）。（2）躯体功能评估：衰弱组握力（17.9±5.0）kg明显低于衰弱前期组（22.1±6.0）kg和非衰弱组（26.2±5.9）kg（F=31.434，P＜0.001）；衰弱组步速（0.5±0.2）m/s要明显低于衰弱前期组（0.8±0.2）m/s和非衰弱组（1.1±0.2）m/s（F=104.174，P＜0.001）；5次起坐时间在衰弱组为（31.6±20.4）s明显高于其他两组（F=29.639，P＜0.001）；3米起立行走时间在衰弱组为（23.2±12.8）s明显高于衰弱前期组（14.7±7.4）s和非衰弱组（9.9±2.9）s（F=36.157，P＜0.001）；衰弱组、衰弱前期组、非衰弱组的SPPB评分分别为5.0 (3.0-8.0)、9.0（5.7-9.0）、12.0（10.0-12.0），3组比较差异有统计学意义（Z=90.870，P＜0.001）。（见表1）

（二）入组者炎症指标和氧化应激指标比较情况

1. 炎症指标：衰弱组血清hsCRP水平3.7（1.3-5.2）mg/L明显高于衰弱前期组1.5（1.0-2.7）mg/L和非衰弱组1.4（0.7-2.1）mg/L（Z=15.214，P＜0.001）；衰弱组血WBC水平（5.9±1.1）×109/L高于衰弱前期组（5.8±1.3）×109/L和非衰弱组（5.4±1.2）×109/L，且3组间差异有统计学意义（Z=3.738，P＜0.05）。

2. 氧化应激指标：衰弱组尿8-oxo-Gsn水平3.8（3.2-4.8）μmol/mol明显高于衰弱前期组3.1（2.5-4.0）μmol/mol和非衰弱组2.8（2.0-3.5）μmol/mol，并且3组比较差异有统计学意义（Z=26.710，P＜0.001）；尿8-oxo-dGsn水平在衰弱组为2.4（1.7-3.5）μmol/mol、衰弱前期组2.4（1.8-3.2）μmol/mol、非衰弱组2.3（1.7-3.1）μmol/mol，3组比较差异无统计学意义（Z=1.306，P＞0.05）。（见表1）

（三）氧化应激指标与躯体功能的相关性

Pearson相关分析显示：尿8-oxo-Gsn水平与握力、步速、SPPB评分呈显著负相关性（r=-0.302、-0.550、-0.350，均P＜0.001）, 尿8-oxo-Gsn水平与5次起坐时间、3米起立行走时间均呈显著正相关性（r=0.257、0.246，均P＜0.001）；其中尿8-oxo-Gsn与步速的相关性最强，尿8-oxo-Gsn的水平随着步速降低而升高（见图1）。尿8-oxo-dGsn水平与躯体功能相关性无统计学意义（P＜0.05）。（见表2）

图1. 尿8-氧化鸟苷（8-oxo-Gsn）水平与步速的散点图（尿8-oxo-Gsn的水平随着步速降低而升高）

（四）影响衰弱的相关因素分析

有序Logistic回归分析结果显示，以衰弱为因变量，年龄（OR=1.10，95% CI：1.012～1.194，P=0.025）、Charlson共病指数（OR=1.51，95% CI：1.109～2.057，P=0.009）、SPPB评分（OR=0.75，95%CI：0.658～0.852，P＜0.001）、血清hsCRP（OR=1.19，95% CI：1.022～1.38，P=0.025）、尿8-oxo-Gsn（OR=1.98，95% CI：1.480～2.651，P＜0.001）是衰弱显著影响因素。在调整了年龄，性别，Charlson共病指数后，尿8-oxo-Gsn水平和hsCRP与衰弱有独立相关性。血WBC、尿8-oxo-dGsn与衰弱之间无显著相关性。（见表3）

图2. 炎症和氧化应激标志物诊断衰弱的ROC曲线 尿8-oxo-Gsn AUC 0.72（95% CI：0.649～0.788，P＜0.001） 尿8-oxo-dGsn AUC 0.47（95% CI：0.397～0.559，P=0.587） 血清hs-CRP AUC 0.69（95% CI：0.610～0.775，P＜0.001） 血WBC AUC 0.55（95% CI：0.476～0.630，P=0.202） 注：8-oxo-Gsn：8-氧化鸟苷；尿8-oxo-dGsn：8-脱氧化鸟 苷；hsCRP：超敏C反应蛋白，WBC：白细胞；sensitivity：敏感 性，specificity：特异性

（五）不同生物标志物对衰弱诊断的价值

应用ROC曲线分析炎症和氧化应激指标对衰弱的预测价值。尿8-oxo-Gsn曲线下面积（Area under the curve，AUC）为0.72（95% CI：0.649～0.788，P＜0.001）；尿8-oxo-dGsn的AUC为0.47（95% CI：0.397～0.559，P=0.587）；血清hsCRP的AUC为0.69 （95% CI：0.610～0.775，P＜0.001）；血WBC的AUC为0.55（95% CI：0.476～0.630，P=0.202）。尿8-oxo-Gsn和hsCRP对衰弱诊断效率有统计学意义（P＜0.001），而尿8-oxo-dGsn和WBC对衰弱诊断效率无统计学意义（P＞0.05）。（见图1）

进一步分析尿8-oxo-Gsn对衰弱诊断的最佳效用值，约登指数=灵敏度+特异度-1，推算最大约登指数，当尿8-oxo-Gsn检测值为3.175mol/mol（尿肌酐校正）时，对衰弱具有最佳诊断效率0.72，其敏感性为0.81，特异性为0.58。

衰弱表型诊断标准包括5项内容，每项内容显示为衰弱的预测因子。应用ROC曲线分析每项内容对衰弱的预测价值（见图3）。在5项内容中，疲劳感的AUC为0.84（95% CI：0.775～0.896）；步速的AUC为0.81（95% CI：0.759～0.867）；握力的AUC为0.75（95% CI：0.687～0.821）；低体能的AUC为0.71（95% CI：0.634～0.789），体重下降的AUC为0.60（95% CI：0.518～0.683）。疲劳感、握力和步速在衰弱诊断中价值较优。

图3. 衰弱表型中5项内容对衰弱诊断的ROC曲线

疲劳感 AUC 0.84（95% CI：0.775～0.896）

步速 AUC 0.81（95% CI：0.759～0.867）

握力 AUC 0.75（95% CI：0.687～0.821）

低体能 AUC 0.71（95% CI：0.634～0.789）

体重下降 AUC 0.60（95% CI：0.518～0.683）

选用疲劳感、步速、握力分别联合氧化应激指标进行组合。通过有序logistic回归建立多变量联合的预测概率模型，将预测概率变量纳入ROC曲线，疲劳感联合尿8-oxo-Gsn的AUC为0.90（95% CI：0.848～0.940，P＜0.001）；步速联合尿8-oxo-Gsn的AUC 0.82（95% CI：0.772～0.877，P＜0.001）；握力联合8-oxo-Gsn的AUC为0.79（95% CI：0.734～0.854，P＜0.001）（见图4）。可见疲劳感联合尿8-oxo-Gsn对衰弱的诊断效率较高。

图4. 预测概率对衰弱诊断的ROC曲线

疲劳感联合尿8-oxo-Gsn 

AUC 0.90（95% CI：0.848～0.940，P＜0.001)

步速联合尿8-oxo-Gsn

AUC 0.82（95% CI：0.772～0.877，P＜0.001）

握力联合尿8-oxo-Gsn 

AUC 0.79（95% CI：0.734～0.854，P＜0.001）

三、讨论

既往研究表明，炎症是导致衰弱的重要因素，氧化应激是促进慢性炎症反应的关键因素。氧化应激促进活性氧（ROS）产生，ROS使细胞内的线粒体损伤引发降解，破坏自由基产生和清除的动态平衡，通过激活核因子KB(NF-kB)通路放大炎症级链反应，形成自由基一炎症一自由基的恶性循环进而加速炎症进程。研究表明氧化应激除促进年龄相关性疾病的发生和发展，部分氧化应激标志物与衰弱及不良临床结局相关。氧化应激增加细胞内钙离子浓度促进蛋白酶活性，加速肌细胞破坏，同时损害神经肌肉接头处的激活及偶联，导致肌肉质量及力量的降低，进而使躯体功能下降和衰弱发生。

通过循环中氧化应激生物标志物的量化检测可评估机体氧化应激水平。但目前常用的氧化应激标志物均需血标本检测，而且操作复杂，价格昂贵。氧化应激主要通过活性氧（ROS）破坏细胞内的核酸、脂质和蛋白质，DNA和RNA前体核苷酸较易被氧化损伤，在各种氧化嘌呤和嘧啶基团中，鸟嘌呤的氧化电位最低，可被氧化形成8-oxo-Gsn和8-oxo-dGsn，核苷酸氧化产物进入血液，再从尿液排出。目前UPLC-MS/MS法定量检测核酸氧化产物已成为金标准，可定量检测尿8-oxo-dGsn和8-oxo-Gsn。前期的动物实验证明，RNA较DNA更容易发生氧化损伤，其原因可能是RNA为单链核酸，缺乏组蛋白保护和完善修复机制，较易成为活性氧攻击的目标。

北京医院老年研究所蔡剑平团队对氧化应激标志物8-oxo-Gsn进行了深入研究，前期研究选取1228名健康中国居民，使用UPLC-MS/MS测定尿标本8-oxodGsn和8-oxoGsn的浓度，并对8-oxoGsn与年龄/性别的关系进行了评价。将受试者年龄按照每10年分组，从21∼30岁组到81∼90岁组，男女的尿标志物均随年龄增长而增加，尿8-oxoGsn的含量与年龄的相关性更强，在个体中比8-oxodGsn的含量高（约2倍）。因此，尿8-oxoGsn是与年龄相关的生物标志物，可用于反应衰老进程。其团队进一步研究发现尿8-oxo-Gsn与增龄相关性疾病关系密切，如糖尿病、慢性肾功能不全、冠心病等。因此8-oxo-Gsn作为RNA氧化损伤产物是反映机体氧化应激水平和衰老的敏感标志物。但有关此标志物与衰弱和躯体功能关系的研究在国内尚未开展。在本研究中，通过Pearson相关分析，尿8-oxo-Gsn与多项躯体功能指标有相关性，其中尿8-oxo-Gsn与步速的相关性较强。在调整了年龄、性别和Charlson共病指数后，尿8-oxo-Gsn水平与社区衰弱老人有独立相关性。当尿8-oxo-Gsn检测值经尿肌酐校正后为3.175umol/mol时，对衰弱诊断的预测价值最优，特异性0.58，敏感性0.81。为提高尿8-oxo-Gsn水平对衰弱的诊断能力，采用logistic回归建立预测概率模型，发现尿8-oxo-Gsn联合疲劳感（一个简单的筛查问题）对衰弱诊断的效用值最优，能较好的反映衰弱状态。两者结合操作简单，适宜在社区推广进行衰弱的筛查，并且提示衰弱老人体内氧化应激水平升高，可为靶向干预提供依据。尿液标本容易获取，尿8-oxo-Gsn稳定，易于储存，可应用UPLC-MS/MS测量。这种尿液生物标记物可能成为衰弱新的评估工具。

本研究的局限性：（1）本研究为横断面研究，未能观察氧化应激标志物与衰弱发展趋势及因果关系，有待进一步的队列研究评估氧化应激标志物对衰弱的预测价值。（2）尿8-氧化鸟苷尚出于基础研究阶段，在向临床转化过程中，其与衰弱的关系需要在不同人群进行验证。（3）尿8-氧化鸟苷的检测金标准为质谱仪检测，设备相对昂贵，已有文献报道探索应用ELISA法检测，但仍在研究阶段，随着对此标志物研究的深入，有待开发出低成本、简单易行的检测方法。