中国六家HBVDNA定量自动化检测系统的临床性能验证

作者：单耀斌   李永利   刘亚楠   夏丽芳   郭桐生

【摘要】目的 对中国六家乙型肝炎病毒DNA定量全自动核酸检测系统进行性能评估。方法 以中华人民共和国医药行业标准《核酸扩增检测用试剂（盒）》为验证依据，部分参照美国《临床实验室改进法案修正案》规定和《医学实验室质量和能力认可准则》完善验证方案，收集162例临床患者样本，以罗氏的COBAS TaqMan HBV DNA v2.0检测系统作为检测对照，进行临床一致性验证试验；以临床108IU/mL样本做梯度稀释进行线性验证；按照说明书：以HBV DNA标准品作为样品，进行准确度、精密度、灵敏度、最低检测限等验证试验；加入一定浓度商品化的胆红素、甘油三脂和阿德福韦酯等作为干扰物进行干扰验证试验；以高浓度和阴性血清设计梅花桩试验验证抗污染能力。结果 不同厂家全自动检测系统完成96个样本的核酸提取和PCR体系构建时间为84-170分钟；所有检测系统线性范围验证实验结果显示R² 均＞0.99。最低检测浓度为10-30IU/mL，仅有一厂家一例未检测出，其他厂家检出率为100%。107IU/mL浓度值样本的重复性、中间精密度分别为：0.31%-1.71%、0.78-2.11%，均符合国家标准；60IU/mL浓度值样本的重复性、中间精密度分别为：3.37%-5.07%、4.10%-8.05%，有一个厂家检测系统超过国家标准中CV≤5.0%。准确度试验结果：测定值与目标值对数的绝对偏差为-0.19-0.33，均＜±0.5的行业标准。与罗氏COBAS TaqMan HBV DNA v2.0检测结果相比：两种检测体系结果高度相关，R² 为0.973-0.991，均符合国家标准R²＞0.950；交叉污染实验显示，所有检测系统携带污染和交叉污染均为阴性，阴阳符合率均为100%。抗干扰试验：干扰Δlg为-0.07-0.14，抗干扰能力强。结论 国内六家乙型肝炎DNA定量自动化检测系统检测体系灵敏度高、精密度好、线性范围宽，抗干扰、抗污染能力突出，检测时间存在较大差异，可满足临床高灵敏度HBV DNA定量检测的需求。

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的慢性感染人数全球有2.5-4.0亿人，20%-30%的成人HBV慢性感染患者发展为肝硬化和肝癌，每年因为慢性HBV感染直接导致死亡人数达50万-75万人，是全球范围内第十大致死性感染，HBV慢性感染是全球公共卫生的巨大挑战。

2015年世界卫生组织（World Health Organization, WHO）首次发布了《慢性乙型肝炎病毒感染患者的预防、护理和治疗指南》，指南指出：在治疗过程中，HBVDNA定量是最重要检测指标之一，用来决定抗病毒治疗起点、监测慢性乙型肝炎病毒感染个体患者的抗病毒治疗等。在2007年，Keeffe等发布的核苷（酸）类似物治疗慢性HBV感染路线图中，同样HBV DNA定量是最重要检测指标之一，60IU/mL和2000IU/mL是两个最重要判断折点。

中国注册多种商品化的基于实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）的HBV DNA定量检测试剂盒，由于实验室条件、检测方法可靠性、检测技术和检测成本等多方面因素，中国很多临床实验室使用的HBV DNA定量检测提取方法主要使用碱裂解法、煮沸法等，HBV DNA定量下限只能到500或1000IU/mL，远不能满足治疗中60IU/mL监测需求。

随着磁珠法用于核酸提取和自动化设备上市，为HBV DNA定量检测带来巨大变化，中国很多生产厂商研制出相应的检测系统，我们对国内六家主流HBV DNA自动化检测系统从线性范围、精密度、准确度、检测下限、抗污染能力、抗干扰和与COBAS TaqMan HBV DNA v2.0检测进行比对，以及仪器提取96份样本时间等进行考察和验证。

一、材料和方法

1. 性能验证的依据：主要参照中华人民共和国医药行业标准《核酸扩增检测用试剂（盒）》（YY/T 1182-2010），部分参照美国《临床实验室改进法案修正案》（Clinical Laboratory Improvement Amendment 88，CLIA'88）规定和《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）。

2. 患者和样本: 收集2015.10-2015.12在302医院就诊并进行HBV DNA定量检测的患者和标本，共162名患者162份样本，这些样本同时使用国产HBV DNA自动化检测系统和COBAS TaqMan检测系统进行检测。

3. 试验样品：临床收集高浓度样本108IU/mL，使用罗氏COBAS TaqMan HBV DNA v2.0检测三次取平均值、使用阴性血清分别稀释E7、E6、E5、E4、E3、E2、E1，康彻斯坦质控品4.6×106IU/mL（GBW(E)090139）、5.9×104IU/mL（GBW(E)090138）、1.41×103IU/mL（ GBW(E)090137），使用小牛血清或者来自献血员的HBV阴性血清稀释标准物质至理论浓度：1.2×102IU/mL、100IU/mL、60IU/mL、50U/mL、30IU/mL、20IU/mL和10IU/mL。

4. 核酸提取和扩增：按照仪器操作说明书操作，血清样本按顺序放入仪器，由仪器自动完成核酸提取和PCR体系构建，同时计时，使用Real-time荧光定量 PCR仪进行扩增，PCR扩增条件按照试剂说明书设定，结果由PCR仪配套软件进行分析。

5. 精密度验证：将标准品稀释成107IU/mL和60IU/mL，分装后在-20℃保存，检测前半小时取出，恢复至室温混匀后检测，每份样本重复检测3次，第一天使用3个批号试剂同时检测，检测结果取对数后做重复性精密度计算；一批试剂连续检测两个水平样本5天，每次检测重复3次，检测结果取对数后计算中间精密度。

6. 准确度验证：将标准品每个浓度重复检测3次，将检测结果取对数后与期望值对数比较。Δlg≤±0.5为合格。

7. 临床样本检测的比较：将高、中、低浓度标本同时使用COBAS TaqMan HBV DNA v2.0和国产自动化检测系统进行检测，每种检测系统至少检测20份标本，含有高中低浓度样本，将结果取对数后一一对应比较，以对数差的绝对值±0.5作为判断，同时求相关系数。

8. 线性和检测下限：按照试剂说明书确定检测范围，将定值为108IU/mL临床样本血清使用人HBV阴性血浆或小牛血清进行梯度稀释，稀释至说明书线性范围最低检测限浓度，每个浓度重复检测3次，取平均值后取对数，检测值和目标值做线性回归。检测按照各自说明书，将国家乙型肝炎脱氧核糖核酸标准物质稀释至的最低检测限浓度，检测25次，计算阳性率，至少22次检测阳性且检测值与期望值对数差≤±0.5判定合格。

9. 抗污染试验：连续进行两批96份样本提取和检测，每批样本包括48个108IU/mL和48个阴性样本，阴性和阳性在提取时交叉呈梅花桩式排列，两个批次样本提取时相对应的孔阴阳性样本交叉。

10. 抗干扰试验：将3.6mg胆红素干粉使用10ml阴性血浆稀释至616μmol/L；一粒阿德福韦酯颗粒溶于1L水制备成10mg/L液体，取50uL加入到10mL阴性血浆中配制成0.05mg/L阿德福韦酯。分别使用上述两种溶液将107IU/mL样本稀释至105IU/mL和103IU/mL，同时检测HBV DNA阴性血清稀释的105IU/mL和103IU/mL样本，每个样本重复检测5次，浓度对数值比较，对数值绝对偏差不超过±0.5。

二、研究结果

1. 不同厂家自动化设备提取96份样本消耗时间见表1，不同厂家的自动化核酸提取仪提取时间差别较大。

2. 精密度结果：107IU/mL作为精密度检测浓度，所有的检测系统中间和重复性精密度均很好，大部分低于1.0%；以60IU/mL作为精密度检测浓度，5个厂家检测系统CV达到≤5.0%的国家标准，一个厂家重复性和中间精密度CV均超过5.0%的国家标准，详细结果见表2。

3. 准确度结果：以国家标准物质作为检测标本，所有检测厂家打靶试验均达到国家标准要求。详细结果见表3。

3. 临床样本检测比对结果：不同厂家检测系统检测比对样本均包括高、中、低浓度样本。比对结果做相关拟合R2均大于0.950国家标准，但不同厂家之间存在差距。详细结果见表4。

4. 线性、定量下限和最低检测限结果：所有厂家线性范围相关拟合后R2值均＞0.99，说明所有厂家检测系统线性结果很好，详细结果见表5；所有厂家定量线性下线检测25次均为阳性，且与期望值Δlg均≤±0.5，符合国家标准，见表6；最低检测限结果符合国家标准，只有一个厂家有一次未检出，见表7。

5. 抗污染试验结果：抗污染试验结果均未发现很明显的交叉污染和携带污染。

6. 抗干扰试验结果：抗干扰结果显示各个检测系统对常见的黄疸、溶血、脂血及药物有较好抗干扰能力，详细结果见表8。

三、讨论与分析

虽然有很多国际自动化核酸检测系统进入中国，包括德国罗氏的COBASTaqMan HBV检测系统，雅培的 RealTime HBV分析系统和凯杰的Artus RealART HBV检测系统，这些国际系统的检测质量和检测稳定性非常好，检测灵敏度也很低，但是存在高浓度检测不好，价格昂贵、检测速度比较慢，不能适应中国国情，难以在临床大规模推广，仅仅适合做一些高端和精细检测。

中国HBV DNA定量自动化检测系统上市稍晚，主要体外定量检测HBV感染患者血清或血浆中HBV DNA，多个厂家的目标基因在HBV DNA的高保守区S区，S区是HBV亚病毒颗粒装配和分泌的重要区域，病毒只能适应很小的结构变化，选择S区的引物意味着能检测基因型A-H的HBV DNA，同时不受耐药突变（YMDD）的影响。

近十年来乙型病毒性肝炎的治疗获得很大进步，主要得益于核苷类抗病毒药物不断发明，包括拉米夫定（3TC）、阿德福韦酯（ADF）、替比夫定（TBV）、恩替卡韦（ETV）、替诺夫韦（TDF）、恩曲他滨（FTC）等。治疗的进步还得益于HBV DNA定量检测技术的进步，血清中HBV DNA的量用来判断治疗反应、决定治疗起点、监测病毒耐药。很多种商品化方法用于HBV DNA定量检测，由于HBV DNA在人的外周血中可以很低（低于10IU/mL），检测下限需要达到10IU/mL，能在HBV DNA的量很低还不足以需要采取临床措施前可以检测到，能够尽早检测到HBV感染患者血清学突破，为临床医生提供实验室证据，及时采取相应治疗调整，可以为病毒学突破患者长期疗效提供支持。也可以很高（高于109IU/mL），检测范围宽的HBV DNA定量检测方法是临床的需求，特别是在低浓度水平检测需要经济、高效的检测方法。本次参加试验的六家公司的产品有两家检测灵敏度限达到10IU/mL，其他四家分别是15、20、20和30IU/mL，达到国家核酸检测试剂盒30IU/mL标准要求。

在中国，HBV感染除引起健康下降，还导致患者及其家庭的沉重经济负担，文献报道HBV感染患者中大约15%-40%进展为慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭以及肝癌等。每年每名感染HBV患者因为肝病导致直接经济损失28285.76-41242.9RMB，平均每个HBV患者每年因为疾病原因的经济消耗是家庭年收入的三倍。其中检测费用是一个重要组成部分，进口的HBV DNA定量检测系统包括罗氏、雅培和凯杰质量好，但是成本很高，中国国产的HBV DNA定量全自动检测系统在提高质量基础上，还能大大降低检测费用。

HBV基因型包括A-I十种，在中国北部主要流行B型，南方以C型多见，在中国的西部的藏族人流行C/D混合型，新疆维吾尔族以D型多见，A型在中国很少见，其他几种基因型在中国还未见报道。A型主要流行于非洲撒哈拉、北欧和西非，B型和C型常见于亚洲，D型在非洲、欧洲、地中海地区和印度流行，E型主要见于西非和中部非洲，也可在欧洲、土耳其、北印度和拉丁美洲的移民和旅行者中散发，F-J型还没有大流行，只在有限地区发现。国产的几种全自动检测系统能够检测基因型能力并不相同，我们限于样本问题没有进行基因型检测能力的验证，根据说明书有两家厂家只检测A-D四种基因型HBV DNA。

总之，验证国产主流全自动乙型肝炎DNA定量检测系统具有不同提取和检测速度，相对于传统方法检测体系灵敏度高、精密度好、线性范围宽，抗干扰、抗污染能力突出，相对于进口产品，能大大降低检测费用，可满足临床高灵敏度HBV DNA定量检测的需求。