开启黄金时代，细菌耐药性研究少不了

肺结核是一种由结核分枝杆菌感染肺部而引起的疾病，其通过活跃性呼吸道疾病病人喉咙或肺部的飞沫微滴核进行传染。肺结核是全球面临的重大问题，但大多数人对其一无所知。总得来说，全球三分之一人口正感染着肺结核，10%以上将发展成活跃性肺结核。每年平均有1700万人死于活跃性肺结核并发症，即每天有4,700例死亡。在非洲更是触目惊心，全球15个肺结核高发国家，13个在非洲，非洲还是HIV感染高发区，南非10%左右的人口携带有HIV病毒。在同一国家内人群同时感染HIV（人类免疫缺陷病毒）和TB(结核分枝杆菌)后发展成活跃性肺结核的几率是仅感染结核分枝杆菌的20至40倍。

当下的结核分枝杆菌（以下简称TB）检测方法有两种，TB培养法（金标准）和涂片镜检法，前者细菌生长慢，培养周期长、对操作人员和设备要求高、需处理各种潜在感染的物质。后者便宜且相对快速、灵敏度不高、易受检测人员主观影响、仅能检测约一半的TB病例。

Luke T. Daum博士

Luke T. Daum从德克萨斯大学取得了细胞和分子生物学博士，随后花费了8年时间来建立和管理空军流感病毒毒株监控实验室。2007年离开空军，参与创建疫苗诊断公司。近期基于Ion Torrent PGM测序仪和Ion 314芯片，开发了肺结核药物敏感性检测方法，此方法能帮助快速分析结核分枝杆菌基因的全部编码区域。

Q：您最近开发了什么新的检测方法呢？

Luke T. Daum博士：我们开发了一种基于Ion Torrent PGM测序仪和Ion 314芯片的肺结核药物敏感性检测方法，能帮助我们快速分析TB基因的全部编码区域，该区域与药物灵敏性和抗药性有关。4%至6%的TB感染者对一种或多种常用于治疗肺结核的抗生素存在抗性。我们开发TB检测法不是为了用于临床诊断，而是用于不同地理区域内重要菌株的流行病学监控，提供及时有用的信息，帮助医务人员监测TB的多重药物抗性或者泛多重药抗性。

使用Ion PGM让我们不仅能监测已知的与药物抗性相关的SNP，而且能够发现新的抗药性相关SNP，因为我们对全基因组进行了测序。Ion Torrent的适应性能够帮助我们观察到所感兴趣的基因的全部编码区域，当发现新SNP后，即可扩展到对整条基因的分析。这是一种功能强大的工具。

 Q：您能否介绍一下当下是如何对TB进行监控的？ 一旦使用Ion Torrent，这将会发生怎样的改变？

Luke T. Daum博士：当下TB药物敏感性是通过培养法分析完成的。他们需要通过培养来鉴定样本是否是TB感染者，然后再花费4至16个星期来进行药物敏感性检测，甚至更久。我们的基于Ion Torrent系统的检测方法，获取相同信息仅需2天左右。

Q：您的这个项目进展如何呢？

Luke T. Daum博士：截止目前，我们已经完成了对12例肺结核样本的测序，其中几例已被发现存在多重抗药性，这意味着他们对正在使用的抗生素产生了抗性。

Q：您能否告诉我们关于检测目的基因的更多信息吗？ 对于是什么引起了抗药性现在大家了解了多少？

Luke T. Daum博士：以往学术论文描述了一些与TB抗药性和药物敏感性相关的SNP。作为佐证，我们也以3条重要的相关基因来开始我们的项目，包括rpoB基因、katG基因和gyraseA基因，这些基因包含了重要的SNP，与3种抗结核药物Rifampicin、Isoniazid、Fluoroquinolone的抗药性相关。Ion Torrent的妙处在于其适应性。是的，我们能够观察到以往学术论文所提及的SNP，且通过IonTorrent，我们还能观察到全部的基因，并跟踪和监测其新的变化，这些变化可能在上述3条重要基因中未曾发现过。 

Q：您为何选用Ion Torrent平台来做这个项目？

Luke T. Daum博士：我做测序做了12年，依我看，正如手机改变了人类的人际交往，Ion Torrent也将改变分子医学。Ion Torrent不仅是一台核心测序平台，正如其名称PGM所意涵的，更是一台个人化操作基因组测序仪(Personal Genome Machine)，小巧而光滑，没有任何可移动性部件，没有激光，且能够被整合和优化，以便让世界上资源缺乏的地方也能用上。我们也在不断优化TB药物敏感性检测方案，以便PGM能够整合到每一个实验室，甚至于非洲那些偏远地区的实验室。

Q：Ion Torrent的读长和覆盖率如何？

Luke T. Daum博士：Ion Torrent的读长是迄今可观的，达50至100bp。依据我们现行的实验方案，通过Ion Torrent我们能够得到500至1,000倍的覆盖率。

（注：Daum博士所述为314芯片，而今318芯片的读长已经突破200 bp）

Q：数据分析方面如何呢？

Luke T. Daum博士：我们使用的软件包是DNA Star公司和赛默飞合作推出的Lasergene NextGen，使用起来非常简便，帮助科学家每天都能对其所感兴趣的基因进行快速有效地对序列分析。我能够将从Ion Torrent服务器中导出的原始序列数据(比如FASTQ文档，导入到软件中，进行SNP分析、多序列比对、系统发生树构建。如果我能这样进行生物信息学分析，那么就意味着任何人都可以这样做。

Q：基于您使用半导体测序技术的经验，您能告诉我它还有其他的应用吗？

Luke T. Daum博士：我一直在使用Ion Torrent测序仪寻求流感病毒全基因组测序的方法，并且我认为将来流感病毒全基因组测序不再需要进行前期PCR预扩增。但是具有代表性的是，大家依然在使用Sanger测序法对PCR扩增子进行测序，特别是在军队和CDC内部。我认为从对特定基因和特异性PCR产物进行测序转变到对全基因组进行测序是十分重要的。通过对全基因组测序，包括流感病毒内部基因，让我们对流感病毒的持续存在和大暴发，及世界上新毒株的源源不断的出现，有更深入的了解。

Ion PGM™ 系统结合PathAmp™ FluA试剂及用于Torrent Suite™ 软件的病原体分析插件，可以使研究人员在不到一天内完成甲型流感分型，获得的高精度序列数据，从而对流感追溯研究样品进行更有效的分析。Ion PGM™ 系统可对成百上千的基因进行分型研究，快速、经济地给出全基因组序列信息，从而对于单一菌株获得更高的分辨能力和更精确的分型信息。随着Ion PGM™ 系统的通量越来越高、精确度越来越准确、读段越来越长，其逐渐被用来对特定疾病类型的追溯样品进行分析、监测，研究其发作方式，并进一步确定其病原学信息，这一领域的开拓开启了细菌耐药性研究的黄金时代。

赛默飞世尔科技（中国）有限公司 供稿