浅谈乙肝表面抗原突变和检测策略

乙型病毒性肝炎（乙肝）HBV是由乙型肝炎病毒引起的传染病，患者感染乙肝后将发展为肝硬化或者肝癌。中国是乙肝高流行国家，乙肝感染率高，有9千万乙肝病毒感染者，其中慢性乙肝病人多达2800万人。中国乙型肝炎病毒感染呈现慢性化的主要原因是感染多始于幼龄，以母婴垂直传播为主，终身携带，难以清除。乙型肝炎病毒的基因型分为8个基因型，分别为A、B、C、D、E、F、G和H型。中国HBV的基因型以B型和C型为主。

HBV是DNA病毒，但是HBV病毒的复制过程与逆转录病毒非常类似。HBV感染肝细胞后，部分双链环状HBV DNA在细胞核内被改装成为共价闭合环状DNA（cccDNA），继而以cccDNA为模板合成基因组mRNA，基因组mRNA通过逆转录酶逆转录为基因组DNA，与包膜蛋白形成完整的病毒颗粒。基因组mRNA在反转录过程中由于逆转录酶缺乏3’-5’外切酶活性，容易发生碱基配对错误，因而导致HBV基因高突变的特性。长期慢性感染过程，乙肝疫苗的使用以及核苷酸类抗病素药物使用等外来压力的作用，HBV常发生选择性变异。数据显示HBV DNA每个复制循环中每10000个碱基对可发生1个核苷酸错误。

HBV四个开放读码框（ORF）包括S区、X区、C和P基因区均可能发生突变，导致乙肝病毒生物学行为的改变，进而干扰临床的检测和治疗。其中S区编码乙肝表面抗原HBsAg，HBsAg是跨膜蛋白，可以根据其在细胞膜上的分布，将HBsAg分为膜外区，穿膜区和膜内区，其中膜外区的“a”决定簇（图1）是突变的热区，常见的氨基酸突变位点见图1。目前HBsAg检测试剂盒主要检测“a”决定簇的AA141-145表位，其突变后，检测试剂无法识别HBsAg。临床上会出现HBsAg检测结果为阴性，但血清和/或肝脏中仍存在HBV DNA，这种情况称为隐匿性HBV感染（OBI）。

图1 乙肝表面抗原HBsAg蛋白构象和“a”表位

OBI患者如果不能及时发现，如果作为献血者献血或者进行手术，都会对输血和/或者手术安全构成安全隐患。一份在献血者中的研究分析发现，9023例乙肝表面抗原（HBsAg）阴性的无偿献血者中，共发现17例HBV DNA阳性，隐匿性HBV感染者的发生率为0.19%，对不一致样本进行序列分析显示其中6例在HBsAg“a”表位（aa124~aa147）存在不同程度的氨基酸突变，突变率为42.9%。另一项针对浙江地区无偿献血者隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究发现，25例血浆HBsAg检测阴性HBV DNA检测阳性样本通过测序序列分析，有5例在HBsAg“a”表位（aa124~aa147）存在突变（20%）。

那么如何解决HBsAg突变带来乙肝检测漏检的问题呢？

1. 增加针对乙肝表面抗原不同位点的抗体

目前主流的全自动化学发光乙肝表面抗原的检测试剂盒多采用双抗夹心的检测方法，针对乙肝表面抗原表位也多选择两种以上的单克隆抗体，下图（图2）列举不同厂家HBsAg检测抗体数量。

图2 不同厂家HBsAg检测试剂盒使用的抗体数量

索灵诊断收购Murex公司后，上市了LIAISON XL Murex HBsAg检测试剂盒，该试剂盒采用7株针对乙肝表面抗原不同表位的单克隆抗体，是目前市面上靶向最全面的抗体设计。这7株单克隆分别靶向HBsAg的“a”表位，穿膜区和膜内区。相比较膜外“a”表位，穿膜和膜内区的序列保守，不易发生突变，固相磁微粒上偶联了分别靶向“a”表位，穿膜和膜内区的单克隆抗体，异鲁米诺标记了四株分别针对“a”表位，穿膜和膜内区的单克隆抗体（图3）。这样的抗体设计有力的保证了HBsAg检测的灵敏度，避免由于“a”表位突变导致的漏检。众多的文献数据提示LIAISON XL Murex HBsAg检测试剂盒对HBsAg突变株检测的卓越性能表现。

图3 索灵LIAISON XL Murex HBsAg检测试剂盒单克隆抗体

与HBsAg抗原表位结合示意

2. 打开乙肝表面抗原的空间结构，形成线性，充分暴露抗体和抗原结合的位点

抗体和抗原表位的结合需要表位的充分暴露，特别是针对穿膜和膜内部位的抗原表位，需要特定试剂将HBsAg从膜上解离下来，才可能充分暴露表位。

不同的厂家采取的不同的解离策略，以索灵诊断HBsAg检测试剂盒为例，该检测试剂中采用获得专利技术的强变性剂，可以充分打开HBsAg蛋白构象，暴露乙肝表面抗原的结合表位，使得针对不同表位的单克隆抗体与HBsAg的“a”表位，穿膜区和膜内区进行充分结合和反应。

不同厂家HBsAg突变株检测能力比较下图（图4）： 

中国是一个乙肝大国，慢性乙肝患者的人数众多，且随着疫苗和核苷类抗病毒药物较广泛的使用，乙肝的突变和耐药将是一个临床不容忽视的问题，特别是对于乙肝临床诊断，HBsAg突变导致的隐匿性乙肝是一个棘手但又非常重要的问题，索灵诊断开发的Murex HBsAg定量检测试剂盒提供了完美的HBsAg突变检测方案。除了Murex HBsAg定量检测试剂盒外，索灵诊断可以提供目前唯一进口发光HBeAg定量检测试剂盒以及完整术前八项检测方案，助力于传染病精确检测和诊断！

参考文献

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 索灵诊断医疗设备（上海）有限公司 供稿