对地震创伤患者进行血浆DNA定量的临床意义

摘要：本研究的目的在于评估可用作体内细胞死亡指标的血浆DNA水平是否与创伤患者的损伤严重程度相关，以及血浆DNA水平定量是否可用于监测创伤患者的治疗效果。我们建立了一种准确定量血浆DNA的新方法，即使用内标的双重实时PCR检测，并用于测定1187位中国健康成年人以及在中国汶川地震中的283位创伤患者的血浆DNA浓度。用我们新开发的实时PCR方法测定的血浆DNA浓度不受DNA提取方案、PCR扩增效率和样本误差的影响。女性的中值血浆DNA浓度显著低于男性（16.9ng/ml vs. 22.6ng/ml，p＜0.0001）。在95%置信区间，男性和女性血浆DNA浓度的正常参考区间分别为0~50ng/ml和0~40ng/ml。在损伤早期，患者的中值血浆DNA水平高于100ng/ml，是健康对照的五倍。ISS评分与血浆DNA浓度之间存在统计学显著正相关（R2=0.46，p＜0.0001）。有无器官损伤的患者之间的血浆DNA浓度存在统计学显著差异（中值，168.9ng/ml vs. 96.7ng/ml，p=0.001）。这种新建立的血浆DNA定量方法提供准确的定量测量，并可用于确定损伤严重等级和疾病过程。

关键词：血浆，DNA，创伤，双重实时PCR

— 简  介 —

自1948年首次报道细胞外DNA以来，大量证据表明无细胞基因组DNA升高和异常可见于很多病理情况，比如恶性肿瘤、产前疾病、创伤、自身免疫疾病、器官功能不全和中风。为了更精确地测量血浆DNA，我们建立了一种使用内标的新型定量检测方法。

在本研究中，为了评价血浆DNA定量方法是否可用于明确体内细胞死亡与损伤严重程度的相关性以及监测创伤患者的治疗效果，我们检测了1187位中国健康成年人以及在2008年5月12日中国西南发生的汶川地震中的283位创伤患者的血浆DNA浓度。

— 材料和方法 —

研究人群

共招募了1187位到南京医科大学第一附属医院进行年度健康体检的健康成人并获得了他们的知情同意书。共招募了283位经历致命性中国汶川地震后转诊到中国江苏省六家综合医院和距离中国四川省震中较近的一家重庆市综合医院的创伤患者（中值年龄，50岁；150位女性）。

血样处理

采集外周静脉血2ml于4ml的EDTA抗凝真空采血管中。所有血样均在收集后2小时内进行处理。室温1,600g离心10分钟后，将血浆转移到1.5ml离心管中，转移过程中要尤其小心，避免破坏血沉棕黄层。再于4℃ 16,000g次离心10分钟以清除任何残留血细胞，收集上清液。将50,000拷贝的质粒DNA加入到每份200μl无细胞血浆样本中，每份血浆样本的质粒DNA浓度为2.5×105 copies/mL，冷冻储存于-70℃供进一步处理。

DNA提取和双重实时PCR

使用BILATEST Viral DNA/RNA Kit（BILATEC，Viernheim，Germany）从含内标的200μl血浆样本中提取DNA。

使用TaKaRa Ex Taq® R-PCR 2.1（TaKaRa，Dalian，China）提供的试剂组份，对同一反应管中总体积为25μL的人β-actin基因和内标重组质粒DNA进行双重实时定量PCR。每个反应体系包含10×Real Time PCR buffer 2.5μl；dNTPs 400μM；MgCl2 6mM；上游引物200nM；共用下游引物700 nM；TaqMan水解探针各100nM；TaKaRa Ex Taq® 热启动DNA聚合酶1U；模板量为2.5μl。所有双重实时PCR实验均包括空白对照。PCR扩增反应条件：（1）95℃，5min；（2）94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s（共45个循环）。使用Applied Biosystems 7500 Sequence Detector（Applied Biosystems，CA，USA）在96孔反应板中进行DNA扩增。分别在通道1和2中检测FAM和JOE标记探针的荧光信号。本研究使用的所有引物和探针均由Primer Express® 软件版本3.0设计。

数据分析

使用Sequence Detection System Software（版本1.4，Applied Biosystems）分析双重扩增曲线。定量结果计算公式如下，单位为千基因组-当量/升（kilogenome-equivalents/L）：

其中，C代表DNA浓度（kilogenome-equivalents/L），E指平均扩增效率，Ct是循环阈值，下标b和p分别代表人β-actin和质粒。使用6.6pg DNA/细胞（2-基因组-当量）作为转换因子将浓度单位转换为ng/ml。

所有统计分析均使用Stata/SE 9.2（Stata Corporation，CollegeStation，TX，USA）完成，P＜0.05为有统计学意义。

图1. 对中国健康志愿者血浆中无细胞DNA的定量分析。a. 柱状图表示各血浆DNA水平的标本正偏态分布。b. 健康男性和女性成人血浆样本中总血浆DNA的箱形图。在箱形图中，方格的上限和下限以及方格之间的横线分别表示第75百分位、第25百分位和中值。水平条分别表示第95和第5百分位。上叉形和下叉形分别表示第99和第1百分位。上下水平短条分别表示最大值和最小值。女性的中值血浆DNA浓度显著低于男性（p＜0.0001）。c. 男性和女性的血浆DNA浓度与其年龄的相关性。根据每位男性和女性的血浆DNA浓度（y周）及年龄（x轴）绘图。男性（R

2=0.0679，p＜0.0001）和女性（R2=0.1575，p＜0.0001）的血浆DNA浓度与年龄之间均存在较弱但统计学显著的正相关。在95%置信区间，男性和女性血浆DNA浓度的正常临界上限分别为51.6ng/ml和40.2ng/ml（水平线）。

— 结  果 — 

健康志愿者的血浆DNA浓度

本研究包含1187位健康志愿者（中值年龄，40岁；510位女性）。所有血浆DNA定量重复执行两次。血浆DNA水平分布如图1a所示，其浓度与性别相关。女性的中值血浆DNA浓度显著低于男性（16.9ng/ml vs. 22.6ng/ml ，p＜0.0001）（图1b）。通过Spearman秩相关检验发现，男性和女性的血浆DNA水平均与年龄存在较弱的正相关（图1c）。在95%置信区间，男性和女性血浆DNA浓度的正常参考区间分别为0~50ng/ml和0~40ng/ml。

创伤患者的血浆DNA浓度

如图2所示，男性创伤患者的中值血浆DNA浓度约为对照组的5倍（108.9ng/ml vs. 22.6ng/ml，p＜0.0001，图2a），女性创伤患者的中值浓度约为对照组的7倍（117.3ng/ml vs. 16.9ng/ml，p＜0.0001，图2b）。经过一周治疗后，男性创伤患者的中值血浆DNA浓度下降至67.9ng/ml，女性下降至79.8ng/ml，并继续下降。然而，在损伤7周后创伤患者与对照组的血浆DNA浓度之间仍存在显著差异（男性49.9ng/ml vs. 22.6ng/ml，p＜0.0001；女性53.1ng/ml vs. 16.9ng/ml，p＜0.0001）（图3）。

图2. 对照和地震创伤患者每隔一周血浆样本中的循环DNA水平箱形图。以常见的对数刻度绘制血浆DNA浓度（y轴）。在箱形图中，方格的上限和下限以及方格之间的横线分别表示第75百分位、第25百分位和中值。上下水平条分别表示第95和第5百分位。虚线分别表示男性（a）和女性（b）血浆DNA水平的正常参考区间上限。单独绘制了进入ICU的一位患者的数据（a）。

图3. 平均血浆DNA浓度和损伤严重程度之间的关系。a. 创伤患者的血浆DNA浓度根据不同的ISS等级分为三组。数据用散点图表示，水平线代表平均血浆DNA浓度。b. 血浆DNA浓度（y轴）与ISS的相关性（r2 =0.36，p＜0.0001）。

图1. 对中国健康志愿者血浆中无细胞DNA的定量分析。a. 柱状图表示各血浆DNA水平的标本正偏态分布。b. 健康男性和女性成人血浆样本中总血浆DNA的箱形图。在箱形图中，方格的上限和下限以及方格之间的横线分别表示第75百分位、第25百分位和中值。水平条分别表示第95和第5百分位。上叉形和下叉形分别表示第99和第1百分位。上下水平短条分别表示最大值和最小值。女性的中值血浆DNA浓度显著低于男性（p＜0.0001）。c. 男性和女性的血浆DNA浓度与其年龄的相关性。根据每位男性和女性的血浆DNA浓度（y周）及年龄（x轴）绘图。男性（R

2=0.0679，p＜0.0001）和女性（R2=0.1575，p＜0.0001）的血浆DNA浓度与年龄之间均存在较弱但统计学显著的正相关。在95%置信区间，男性和女性血浆DNA浓度的正常临界上限分别为51.6ng/ml和40.2ng/ml（水平线）。

入院时使用损伤严重程度评分（ISS）评估47位创伤患者的损伤程度，包括4位中度损伤患者（ISS 0-15）、17位重度损伤患者（ISS 16-25）和26位非常严重损伤患者（ISS＞25）。第三周，非常严重损伤患者（ISS＞25）的中值血浆DNA浓度显著高于重度（ISS 16-25）和中度（ISS 0-15）损伤患者（177.4ng/ml vs. 93.6ng/ml和61.8ng/ml，p=0.0005，图3a、表2）。ISS与血浆DNA浓度之间存呈正相关（r2=0.36，p＜0.0001，图3b）。四肢损伤患者的血浆DNA浓度显著低于头/颈部损伤、胸/腹部损伤和多发损伤的患者（88.9ng/ml vs. 129.7ng/ml，139.6ng/ml，147.8ng/ml，p=0.0012，表2）。一位四肢损伤非常严重的患者，其血浆DNA浓度高达119.2ng/ml，在所有患者中浓度最高，最后进行了腿截肢。

根据计算机断层扫描（CT）检查，11位患者被诊断为包括肺挫伤、脾脏和大脑损伤的器官损伤。有无器官损伤的患者之间血浆DNA浓度存在统计学显著差异（168.9ng/ml vs. 96.7ng/ml，p=0.001，表2）。其中一位血胸、气胸的男性患者收住ICU后，血浆DNA浓度从266.8ng/ml升高至563.7ng/ml，经过气管切开术和人工通气治疗后浓度下降到200ng/ml以下（图2a）。

47位创伤患者均接受了抗感染治疗，其中8位有伤口感染。在抗感染治疗之前有无伤口感染的患者之间血浆DNA浓度不存在显著差异（141.8ng/ml vs. 103.1ng/ml，p=0.0842，表2，图4a）。经治疗后，无伤口感染的患者的中值血浆DNA浓度下降，而有伤口感染的患者的中值浓度仍维持在高水平（65.5ng/ml vs. 145.5ng/ml，p=0.0002,，表2）经过清创引流术后下降（图4b）。

图4. 创伤患者治疗前后的血浆DNA浓度。无伤口感染的创伤患者血浆DNA浓度在抗感染治疗后大幅下降（p=0.0000，Wilcoxon配对符号秩检验），但仍高于对照（p=0.0000，Mann-Whitney两独立样本秩和检验）。有伤口感染的创伤患者血浆DNA浓度在抗感染治疗后仍维持在高水平（p=0.9165，Wilcoxon配对符号秩检验），且在手术之前没有下降（p=0.0431，Wilcoxon配对符号秩检验）。

— 讨  论 —

自2000年以来，有些研究报告了各种疾病患者的血浆DNA升高，但是很少有关注健康个体血浆DNA水平的正常参考区间建立的大样本研究。我们使用新建立的双重实时PCR检测方法，测定了1187位健康中国志愿者的血浆DNA水平。这是全世界第一项进行大样本血浆DNA定量的研究。

有趣的是，本研究结果表明男性的血浆DNA水平显著高于女性。这一点以前尚未报道过。我们推测这一发现与男性代谢率高于女性但预期寿命低于女性有关。这意味着未来关于各种疾病患者的血浆DNA水平的定量研究应更谨慎地考虑性别因素。

目前，大家普遍认为无细胞DNA主要通过有核细胞等细胞凋亡和坏死进入循环。在创伤情况下，大量细胞死亡导致血浆DNA升高并超过正常参考范围。本研究及其他研究均发现创伤患者的血浆DNA显著升高而且血浆DNA浓度升高与损伤严重程度相关。研究数据显示头/颈部、胸/腹部和多发损伤患者的血浆DNA水平高于仅四肢损伤的患者。这表明血浆DNA升高可能是来源于并发症导致的体内细胞死亡。Lo等研究发现人血浆DNA循环半衰期较短。因而，发生损伤后血浆DNA会在几天内从高水平降至正常水平，除非存在持续细胞死亡（例如器官损伤、感染、血胸和气胸）和/或肝脏和肾脏功能不全，阻碍循环中血浆DNA清除。本研究中一位收住ICU的患者，在采取重症护理治疗之前其血浆DNA浓度极高且有上升趋势，治疗后逐渐下降至正常参考范围。这表明血浆DNA定量可用于评估体内细胞死亡和监测创伤患者的恢复状况，可持续监测血浆DNA浓度以评估体内细胞死亡。血浆DNA水平在损伤严重程度评价上比传统ISS指标有优势。

近年来，公共突发事件如炸弹爆炸、恐怖袭击等，由于伤亡巨大和急救困难引起越来越多的关注。在临床实践中，尤其是涉及大量人群的公共突发事件，测量血浆DNA可使医生快速评估创伤的严重程度，判断哪些是危重创伤患者并需要从急救点转移到条件完善的综合医院，最终在有限的医疗资源下选择最适当的治疗。