痰液SRCIN1和HOXB4基因甲基化检测在肺癌诊断中的临床价值
赵晓涛，教授，主任医师，博士研究生导师。现任北京大学人民医院检验科副主任。主要从事肿瘤、病原等临床分子检测及相关基础研究工作。作为课题负责人获国家自然科学基金资助项目、北京市自然科学基金资助项目等资助；以第一或通讯作者发表核心期刊及SCI收录论著多篇。担任“十二五”普通高等教育本科国家级规划教材《临床分子生物学检验技术》编委。学术兼职：担任北京大学医学部医学检验学系委员；中华医学会检验分会分子学组委员；中国老年医学会检验医学分会常委；中国老年保健学会检验医学分会常委；中国中西医结合学会检验医学专委会委员；中国医疗保健国际交流促进会基层检验技术标准化分会委员；北京医学会检验医学分会委员；北京医师协会检验专科医师分会理事；北京中西医结合学会检验医学专业委员会常委。
杨雨，北京大学人民医院检验科临床型硕士研究生，研究方向为DNA异常甲基化检测在肿瘤诊疗中的应用。
【摘要】目的：DNA异常甲基化发生在肺癌早期，并随着疾病的进展及治疗动态变化。本文研究肺癌患者痰液中的SRCIN1和HOXB4基因甲基化情况，以评估其在肺癌诊断中的临床价值。方法：收集肺癌组共29例，对照组中非恶性肺部疾病共47例。采用定量甲基化特异PCR检测痰液SRCIN1和HOXB4基因甲基化水平。采用卡方检验分析SRCIN1 和HOXB4基因甲基化与临床病理特征间的相关性。结果：肺癌组中SRCIN1和HOXB4基因甲基化检出率高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.001）。肺癌组血清CYFRA21-1、NSE水平与对照组相比，差异具有统计学意义（P=0.006，P=0.011）。痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化检出率与肺癌肿块的直径相关，肿块直径＞3cm的肺癌患者中检出率更高，差异具有显著性（P=0.01）。结论：痰液SRCIN1和HOXB4基因甲基化检测对肺癌诊断具有一定价值，且可能与肺癌进展相关。
【关键词】肺部肿瘤；DNA甲基化；SRCIN1基因；HOXB4基因
肺癌已成为癌症死亡的首因，多数确诊肺癌的患者5年生存率仅为10%~20%[1]。多轮低剂量螺旋CT筛查可显著降低有吸烟史的高风险人群的肺癌死亡率[2-3]，但对肺部结节鉴别诊断能力欠佳。且一项肺癌高危人群的低剂量螺旋CT筛查的依从性研究表明，中国城市地区肺癌高危人群筛查的依从性仍有待提高[4]。DNA异常甲基化检测是液体活检技术从表观基因组学角度助力肺癌诊断的一种重要的技术手段。DNA异常甲基化是一种稳定的改变，在疾病的不典型增生期即可出现[5]，并在癌症进展过程中持续存在[6]，可通过特异性PCR方法进行量化，从而在肺癌诊断尤其是早期诊断方面具有显著优势。我们通过查阅大量文献及前期预实验后，选择研究肺癌患者痰液中的SRCIN1和HOXB4基因甲基化情况，以评估其在肺癌诊断中的临床价值。
一、材料与方法
1. 临床对象和样本收集：选取北京大学人民医院2022年6月-2023年3月的检测者共76例，男性61例，女性15例，年龄21~84岁，平均64岁。肺癌组共29例，其中鳞癌12例，腺癌13例，小细胞癌3例，大细胞神经内分泌癌1例。对照组中非恶性肺部疾病共47例。所有患者均在自愿的前提下，签订知情同意书。本研究遵从修订版的赫尔辛基宣言，得到医院伦理委员会的认可。纳入标准：肺癌组均经病理组织学确诊为肺癌，按WH02015版组织学分类，按国际抗癌联盟（UICC）第8版肺癌分期标准进行分期，所有患者采样前均未接受抗肿瘤治疗，也未患有其他肿瘤。
2. 检测方法：痰液SRCIN1和HOXB4基因甲基化检测采用定量甲基化特异PCR（quantitative methylation-specific PCR，qMSP）检测患者痰液SRCIN1和HOXB4基因甲基化水平。采集同一受检者的2~3管痰液作为1例有效临床样本；受检者每天只能采集1管痰液样本，每管需要采集1~2口痰。向痰液样本中加入200μl 4M NaOH涡旋混匀30秒，室温静置1小时。待痰液完全解稠后，加入200μl 4M HCl，涡旋混匀15秒。瞬离取500μl样本至2ml离心管中。采用吸附柱法提取DNA，并使用Nano-drop100核酸定量分析仪（美国Thermo公司）测定DNA的纯度和浓度，要求所提DNA的A260/A280在1.7～1.9之间。使用重亚硫酸氢钠试剂（广州康立明生物科技股份有限公司）对提取的DNA进行修饰备用。PCR反应条件为95℃，5min，45个循环（95℃，15s；58℃，5S；72℃，30S），25℃，1min。每个样本重复3次。qPCR的检测结果的判读标准如表1所示。
3. 肿瘤标志物检测：取患者手术前空腹外周静脉血5ml，3000r/min离心10min取上清液，参照Elecsys 2010电化学发光免疫分析仪及配套的测定试盒（上海罗氏有限公司）使用说明书，使用电化学发光法检测血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角蛋白19片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，cyfra21-1）、神经元特异烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、胃泌素释放肽前体（pro-gastrin releasing peptide，ProGRP）、鳞状细胞癌相关抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）的水平。
4. 统计学分析方法：所有数据采用SPSS23.0软件进行统计学处理。不同组别间的比较采用x2检验，甲基化检出率与临床病理特征的相关性分析采用Fisher精确检验法。肿瘤标志物水平比较采用独立样本T检验。构建受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC），并计算曲线下面积（area under curve，AUC）。敏感性=真阳性例数／（真阳性例数+假阴性例数），特异性=真阴性例数／（真阴性例数+假阳性例数）。所有P值均取双侧，P＜0.05为差异有统计学意义。
二、研究结果
1. 肺癌患者痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化检出率及部分肿瘤标志物水平比较：肺癌患者中SRCIN1和HOXB4基因甲基化检出率为65.5%（19/29），对照组中8.5%（4/47），肺癌组与对照组相比SRCIN1和HOXB4基因甲基化更易检出（x2=27.616，P＜0.001），差异具有统计学意义（图1）。肺癌组血清CYFRA21-1、NSE水平与对照组相比（表2），差异具有统计学意义（P=0.006，P=0.011）。
2. 痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化与肺癌患者临床病理特征的关系：痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化检出率与肺癌肿块的直径相关，肿块直径＞3cm的肺癌患者中检出率较高，差异具有显著性（P=0.01）。它与患者年龄、吸烟史、组织学类型、淋巴结转移、远处转移均无关（P＞0.05，表3）。
3. SRCIN1和HOXB4基因甲基化及血清CYFRA21-1、NSE水平对肺癌诊断效能的比较：应用ROC曲线评估痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化对肺癌诊断价值（图2）。SRCIN1和HOXB4基因甲基化区分肺癌组与对照组的AUC为0.785（95% C1=0.669~0.901，P＜0.001），敏感性为82.6%，特异性为80.4%。CYFRA21-1诊断肺癌的AUC为0.822（95% C1=0.724~0.920，P＜0.001）。NSE诊断肺癌的AUC为0.691（95% C1=0.562~0.819，P=0.006）。
图2. SRCIN1和HOXB4基因甲基化及CYFRA21-1、NSE在肺癌诊断中的价值
三、分析与讨论
肺癌发病率和死亡率高，早期肺癌患者通过手术治疗可达到几乎完全治愈的可能，故肺癌的早诊断一直是研究的重点和难点。DNA异常甲基化是表观基因组学的重要内容，在不影响DNA遗传序列的情况下，调控基因表达过程。研究表明甲基化在肿瘤中具有普遍性和早期性，因此甲基化是早期诊断肿瘤的理想分子标志物[7]。此前，已有许多研究者在NSCLC患者的痰液、支气管肺泡灌洗液和血清中检测到基因启动子区CpG岛高度甲基化。多项研究显示SRCIN1基因参与了肺癌增殖和迁移的调控[8-10]，比较非小细胞肺癌组织与其癌旁组织，结果显示肺癌组织中的SRCIN1 mRNA表达水平显著降低[8]。HOX基因参与个体发育和细胞分化，在胚胎发育中决定身体节段边界。HOX基因通过调节下游基因的表达，影响细胞的多种生物学功能，如增殖、生存、迁移、分化以及血管的生成[11]。H0X基因家族包括A、B、C和D四个亚族。研究表明，HOXA家族基因在NSCLC中表达下降，有可能是通过基因甲基化导致的表达下调。HOXA基因在多种肿瘤中表达异常，参与信号转导通路，如FGF、Wt、RA等，与肿瘤的分期和预后有关。研究分析非小细胞肺癌细胞系和组织的甲基化情况，显示HOXB4基因具有显著差异的甲基化[12]。在组织样本的HOXB4基因甲基化检测中，腺癌组织样本较正常组织样本表现出明显的甲基化水平上的差异[13]。本实验主要分析痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化，以评估其在肺癌诊断中的临床价值，为后续研究奠定基础。
本实验采用QMSP法检测痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化在肺癌组和对照组中的发生情况，结果显示基因甲基化在肺癌组中的检出率为65.5%（19/29），在对照组中的检出率对照组中8.5%（4/47），差异均有统计学意义（P＜0.05）。因此SRCIN1和HOXB4基因甲基化可能是肿瘤相关或肿瘤特异性的，提示其可能在肺癌的发生发展中起重要作用，同时为靶向治疗的研究提供新思路和新方向。此外，SRCIN1和HOXB4基因甲基化检出率与肺癌患者年龄、吸烟史、组织学类型均无关（P＞0.05），与肿块直径有关，在直径大于3cm的肿块中检出率更高，差异具有统计学意义，这说明SRCIN1和HOXB4基因甲基化可能是肺癌发生的早期事件，可能与肿瘤的进展相关。
检测血清中肿瘤标志物的水平因具有快捷、灵敏度高的优点而被广泛用于临床，肺癌标志物有CEA、NSE、Cyfra21-1等。Liu等[14]报道Cyfra21-1是非小细胞肺癌最灵敏的标志物，治疗前Cyfra21-1水平可以作为SCLC患者预后差的指标。相比于CEA、ProGRP及SCC，Cyfra21-1和NSE在肺癌组和对照组间存在显著差异。在本研究中也验证Cyfra21-1的肺癌诊断效能优于其他血清学肿瘤标志物。
综上所述，痰液中SRCIN1和HOXB4基因甲基化检测在肺癌诊断中具有一定价值，且可能与肺癌进展相关。但本研究也存在一些不足：肺癌组的例数较少，人群主要分布在肺癌的中晚期，肺癌分期中I/II期的人数较少，无法研究SRCIN1和HOXB4基因甲基化在早期肺癌中的应用价值。后续会继续扩大临床样本的收集，探讨痰液中该基因的甲基化辅助肺癌早期诊断方面的价值。
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