微生物cfDNA测序用于感染性 疾病诊断的分析和临床验证

2019年4月，美国斯坦福大学Samuel Yang教授联合生命科学公司Karius在Nature Microbiology上发表了用微生物游离核酸（cell-free DNA，cfDNA）检测病原微生物的临床验证论文。该项研究共纳入350例患者样本，评估了外周血cfDNA宏基因组高通量测序（Metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS）在血流感染临床诊疗方面的效用。

早期病原鉴定是感染性疾病有效治疗的关键。但在许多临床场景中，病原鉴定仍具有挑战性，主要体现在检测周期较长、可检测的病原体种类较少、检测阳性率低以及检测样本类型的局限性等。基于高通量测序技术的mNGS，可以在不需要培养和预判的情况下，对临床样本中的潜在病原体（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫）进行无偏倚检测，在检测周期、样本类型、阳性率等方面体现了巨大的优势。

cfDNA测序近年来已被证明能够对以前需要侵入性程序的几个适应症进行非侵入性诊断，包括诊断胎儿畸形、检测移植器官排斥反应以及确定或监测癌症。研究发现，血浆cfDNA中存在引起机体不同部位感染的病原体基因组DNA片段。因此，对外周血中微生物cfDNA进行测序，可以提高对多种感染进行无创检测的可能性。

检测方法的性能参数：

研究团队首先对检测方法的性能进行模拟测试，通过将13种参考微生物的基因组DNA剪切成微生物典型cfDNA长度的片段，投入到无感染症状人员的血浆中，对检测限（LoD）、定量限（LoQ）、精准度和分析特异性等指标进行分析，并通过计算机模拟实验扩大检测微生物的范围。

1. 检测限：检测限以每毫升血浆中检测到的微生物特有分子数（molecules of microbespecific cfDNA per microlitre of plasma，MPM）判定，在低人源cfDNA血浆中为33-74 MPM，在高人源cfDNA血浆中为39-103 MPM。计算机模拟实验结果的灵敏度为97%，阳性预测值（PPV）为99%。

2. 定量及线性限：在10-316,000MPM的测量浓度范围内，13种参考微生物在所有血浆中都具有很强的线性关系。对于大多数微生物来说，在任何人类血浆背景中，无论浓度如何，变异系数都不超过50%。

3. 精准度：所有微生物在模拟运行中的变异系数为16.7-18.9%，实验室中为17.9-22.2%。

4. 分析特异性：对环境微生物DNA片段的污染、不同微生物基因组序列的相似性、参考基因组序列中的错误以及临床分离物与参考菌株之间的差异等因素进行特异性分析。

① 与环境污染相关的测试结果：样本总特异性为98%，分析物特异性为99.998%；

② 与微生物基因组序列相似性相关的测试结果：阳性预测值为99.4%；

③ 考虑临床分离物与可用参考序列不同的测试结果：93.6%在物种水平上确定了正确的微生物，阳性预测值为92.1%，所有十个错误的呼叫都在预期的属中；

④ 基因相似物种合并感染的干扰性测试结果：99.3%的微生物有一个MPM。

临床表现

为评估血浆中微生物cfDNA用于感染病原体检测的有效性，研究纳入了350例患者样本，其中348例同时有测序检测和初步血培养结果的样本纳入分析。

结果显示，血培养阳性的63例样本中，cfDNA mNGS阳性样本为59例，符合率为93.7%。在包含组织培养、血清学检测、核酸检测以及血培养等所有检测方法的132例阳性样本中，cfDNA mNGS阳性样本为112例，一致性为84.9%。以脓毒症综合参考标准评判，通过cfDNA mNGS检测到的阳性样本为169例，灵敏度为92.9%，比血培养（63例阳性样本）和所有检测方法（132例阳性样本）对脓毒症预警病因的识别都要高。

在166份未明确或可能引起脓毒症预警的样本中，104份经cfDNA测序未检出明显的微生物cfDNA，即特异性为62.7%。cfDNA认定的可能或不可能导致脓毒症的微生物包括一些重新激活的疱疹病毒、慢性感染（如幽门螺杆菌和人乳头瘤病毒）、可能是共生菌的微生物，以及非脓毒症相关急性感染的可能原因。

总结讨论：

研究结果表明，血浆中的微生物cfDNA测序具有可靠地识别多种感染的潜力。实验中与脓毒症预警患者血培养阳性符合率（93.7%）与其他直接分子诊断方法（包括real-time PCR panel和PCR联合电喷雾电离法）相当或更好。然而，检测到的微生物的敏感性和广谱性，再加上患者体内微生物组组成的多样性，使其很难达到较高的诊断特异性。

另外，虽然单以cfDNA浓度作为真实感染的指标是很方便的，但是微生物的种类和感染的位置都可能影响血浆中观察到的微生物cfDNA的浓度。高浓度的微生物cfDNA通常与真实感染相关，而低浓度的cfDNA同时与真实感染和未知临床意义的共生/定植/污染微生物相关。无论cfDNA浓度如何，在确定cfDNA测序检测到的微生物的临床意义时，必须考虑整个临床情况。

参考文献：

Blauwkamp T.A., Thair S., Rosen M.J., et al. Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nat Microbiol. 2019 Apr; 4(4):663-674.